基于焦磷酸测序技术的GATA3基因甲基化检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于焦磷酸测序技术的GATA3基因甲基化检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括GATA3基因扩增引物GATA3‑mF：TAGGGGATGTAGTGGTTTAAAG和GATA3‑mR：Biotin‑CAGTCAAAAAAACCAACCCT，以及测序引物GATA3‑mS1：GATTGGTTTTTTTAGGTTT、GATA3‑mS2：CGTTTYGGGGTGTTTATTG。本发明专利技术可以低成本、高通量定位定量检测GATA3基因20个CpG位点的甲基化比例，从而精准评估GATA3基因的甲基化水平。

Methylation detection kit and detection method of GATA3 gene based on pyrosequencing technology

【技术实现步骤摘要】
基于焦磷酸测序技术的GATA3基因甲基化检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于核酸体外扩增及甲基化的定位、定量检测领域，具体涉及一种基于焦磷酸测序技术的GATA3基因CpG岛甲基化定量检测引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
世界卫生组织(WHO)统计，全世界女性乳腺癌(Breastcancer)发病率为150万人/年，死亡率57万人/年，乳腺癌正成为危害女性健康、影响女性生活质量的最大威胁。由于乳腺癌的复杂性和异质性，致使临床分期、病理分级甚至分子分型相同的患者对同一治疗方案获益率差异极大，甚至引发毒副作用。由此表明癌细胞的特性并不完全由其DNA序列决定，表观遗传信息(包括组蛋白的乙酰化修饰、DNA甲基化、染色质重塑以及非编码RNA)也参与其中，并逐渐成为肿瘤分子病理研究新的热点。DNA甲基化主要是在CpG甲基化结合蛋白(MBDs)和DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用下，将甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到胞嘧啶(C)的5’端，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。正常人类基因组中约有5000万个5-mC，其中1-2％的CpG位点呈现高度聚集状态，通常位于基因的启动子区，被称为CpG岛，其甲基化修饰异常会促进或阻滞基因的表达。例如，抑癌基因的启动子区高甲基化会导致基因沉默，从而丧失对肿瘤的抑制功能；而原癌基因的甲基化水平下降，会使癌基因活化。因此，检测基因甲基化水平可以作为癌症早期表观诊断指标。GATA结合蛋白3(GATAbingdingprotein3，GATA3)可以作为雌激素受体(ER)的转录必需共调节因子，协助ER活化，参与激活下游Ras-Raf-MEK-MAPK、Src-PI3K-Akt-eNOS信号通路，进而调节乳腺导管上皮细胞的遗传分化方向。临床数据表明，GATA3阳性的乳腺癌患者其组织分化程度高，并且预后较好；而GATA3的缺失可能与乳腺/卵巢肿瘤的发生相关，并且预后较差。目前基因甲基化的检测方法主要包括：甲基化特异性PCR(MSP)、荧光定量甲基化特异PCR(qMSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(MS-HRM)和重亚硫酸盐测序法(BSP)。其中MSP和qMSP仅能定性判断1-2个CpG位点是否发生甲基化；MS-HRM只能对检测片段整体甲基化情况进行分析；BSP能够准确检测目的基因中每一个CpG位点的甲基化状态，但是必需挑取大量克隆进行测序，不适用于大量样本的检测。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶以及双磷酸酶共同催化作用下将每次dNTP的结合与荧光信号偶联，如果与模板配对，聚合酶就可发生反应产生荧光信号。C在Na2SO3处理下转化为T，而5-mC不转变，因此可以用焦磷酸测序观察C/C+T比例，间接反映位点C甲基化和非甲基化比例，得出每个CpG位点甲基化程度的精确数据。焦磷酸测序技术检测通量大、灵敏度高，可以一次实现扩增子上多个CpG位点甲基化水平的定量分析，并可以设置质控监测DNA样本是否转化完全，避免假阳性结果产生，因此是检测基因甲基化的又一“金标准”。文献(ESR1、GATA3、GSTP1基因甲基化与人乳腺癌临床病理特征及细胞耐药关联分析)中采用焦磷酸测序技术对GATA3基因启动子区CpG岛甲基化程度进行检测。但焦磷酸测序结果的准确性和有效性通常受到模板DNA纯度和浓度、扩增引物特异性、测序引物、测序片段长度和测序程序等多因素的影响，易出现由于引物特异性不强、测序片段过长，测序程序不恰当而引起的可疑或失败测序结果，不利于GATA3基因CpG位点甲基化的精准检测，进而影响对GATA3基因甲基化水平的表观效应的揭示。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于焦磷酸测序技术的GATA3基因甲基化检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种基于焦磷酸测序技术检测GATA3基因甲基化的引物，包括GATA3基因甲基化测序引物GATA3-mS1和/或GATA3-mS2，该测序引物与GATA3基因测序片段相匹配，所述测序引物的序列如下所示：GATA3-mS1：5’-GATTGGTTTTTTTAGGTTT-3’GATA3-mS2：5’-CGTTTYGGGGTGTTTATTG-3’。优选的，所述测序引物GATA3-mS1对应的分析序列为：5’-CGCCCCCGCTCGCCCCGCCCCTCTCGCTGGGGCGCCTCGGAGCCGCGTGCCCTCCGCCCCGGGGT-3’；根据该分析序列，测序程序编辑为：5’-YGTTTTYGTTYGTTTYGTTTTTTTYGTTGGGGYGTTTYGGAGTYGYGTGTTTTTYGTTTYGGGGT-3’。优选的，所述测序引物GATA3-mS2对应的分析序列为：5’-CGCAGAGCGTGGCCTGGAGACCCGCGAGCCGGGGAAGGTCGCCGTGGAGTCCCGACCAGAGGCCGGGGTT-3’；根据该分析序列，测序程序编辑为：5’-YGTAGAGYGTGGTTTGGAGATTYGYGAGTYGGGGAAGGTYGTYGTGGAGTTTYGATTAGAGGTYGGGGTT-3’。优选的，所述GATA3基因测序片段采用GATA3基因特异性扩增引物GATA3-mF和GATA3-mR扩增得到，该扩增引物与经重亚硫酸盐转化后的GATA3基因CpG岛序列片段相匹配，所述扩增引物的序列如下所示：GATA3-mF：5’-TAGGGGATGTAGTGGTTTAAAG-3’GATA3-mR：5’-CAGTCAAAAAAACCAACCCT-3’其中，GATA3-mR的5’端带有生物素(Biotin)标记。一种基于焦磷酸测序技术检测GATA3基因甲基化的试剂盒，该试剂盒包括上述GATA3基因特异性扩增引物及GATA3基因甲基化测序引物。优选的，所述试剂盒具体包括以下4个部分：(1)样本(血液、组织、细胞)中基因组DNA提取、重亚硫酸盐转化及纯化试剂：蛋白酶K、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤液、NaOH、重亚硫酸盐转化液(3MNa2S2O5)、DNA保护剂(10mM对苯二酚)和无RNase水；(2)扩增GATA3基因目标区域试剂：10×HS缓冲液、dNTP混合液、Hotstart酶、GATA3基因特异性扩增引物GATA3-mF和GATA3-mR；(3)检测GATA3基因目标区域甲基化的试剂：琼脂糖磁珠、焦磷酸测序结合缓冲液、GATA3基因甲基化测序引物GATA3-mS1和GATA3-mS2、焦磷酸测序退火缓冲液、焦磷酸测序变性缓冲液、焦磷酸测序清洗缓冲液、焦磷酸测序底物、焦磷酸测序酶体系和四种dNTP；(4)焦磷酸测序所用的分析序列的说明书。优选的，所述试剂盒检测的CpG位点选自以下GATA3基因位点(即以GATA3-mF和GATA3-mR为引物对扩增的GATA3基因测序片段中的CpG位点)中的一个或多个：ga本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于焦磷酸测序技术检测GATA3基因甲基化的引物，其特征在于：包括GATA3基因甲基化测序引物GATA3-mS1和/或GATA3-mS2，该测序引物与GATA3基因测序片段相匹配，测序引物的序列如下所示：/nGATA3-mS1：5’-GATTGGTTTTTTTAGGTTT-3’/nGATA3-mS2：5’-CGTTTYGGGGTGTTTATTG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于焦磷酸测序技术检测GATA3基因甲基化的引物，其特征在于：包括GATA3基因甲基化测序引物GATA3-mS1和/或GATA3-mS2，该测序引物与GATA3基因测序片段相匹配，测序引物的序列如下所示：
GATA3-mS1：5’-GATTGGTTTTTTTAGGTTT-3’
GATA3-mS2：5’-CGTTTYGGGGTGTTTATTG-3’。


2.根据权利要求1所述一种基于焦磷酸测序技术检测GATA3基因甲基化的引物，其特征在于：所述测序引物GATA3-mS1对应的测序程序编辑为：
5’-YGTTTTYGTTYGTTTYGTTTTTTTYGTTGGGGYGTTTYGGAGTYGYGTGTTTTTYGTTTYGGGGT-3’。


3.根据权利要求1所述一种基于焦磷酸测序技术检测GATA3基因甲基化的引物，其特征在于：所述测序引物GATA3-mS2对应的测序程序编辑为：5’-YGTAGAGYGTGGTTTGGAGATTYGYGAGTYGGGGAAGGTYGTYGTGGAGTTTYGATTAGAGGTYGGGGTT-3’。


4.根据权利要求1所述一种基于焦磷酸测序技术检测GATA3基因甲基化的引物，其特征在于：所述GATA3基因测序片段采用GATA3基因特异性扩增引物GATA3-mF和GATA3-mR扩增得到，扩增引物的序列如下所示：
GATA3-mF：5’-TAGGGGATGTAGTGGTTTAAAG-3’
GATA3-mR：5’-CAGTCAAAAAAACCAACCCT-3’。


5.一种基于焦磷酸测序技术检测GATA3基因甲基化的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括GATA3基因特异性扩增引物及GATA3基因甲基化测序引物；
所述扩增引物的序列如下所示：
GATA3-mF：5’-TAGGGGATGTAGTGGTTTAAAG-3’
GATA3-mR：5’-CAGTCAAAAAAACCAACCCT-3’
所述测序引物的序列如下所示：
GATA3-mS1：5’-GATTGGTTTTTTTAGGTTT-3’
GATA3-mS2：5’-CGTTTYGGGGTGTTTATTG-3’。


6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王婷，任娟，贺钰婷，乔晓宾，问宇昕，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61