一种农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法，采用ITS序列扩增和DNA分子鉴定确定进口农作物携带的微生物属种；纯化培养该菌株，收集细胞膜并测定其磷酸脂肪酸(PLFA)种类和含量；比较不同生物干重下的PLFA分布图谱，确定菌株的生物取样量范围。数理统计分析PLFA指纹图谱，明确特征脂肪酸的种类和分布；最终利用多元线性回归建立理论模型，通过特征脂肪酸的响应值推算出农作物携带链格孢菌的生物干重。本发明专利技术的定量快速鉴定方法，能够快速鉴定农作物中的链格孢菌，缩短鉴定时间，提高鉴定效率，防止农作物夹杂携带病原菌进行传播，进而保障我国的生物安全。

【技术实现步骤摘要】
一种农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法
本专利技术涉及一种农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法，属于病原链格孢菌鉴定的领域。
技术介绍
农作物中，尤其是进口农作物，如小麦、玉米等农作物，经长途运输，可能使农作物中携带的真菌病爆发，严重影响农作物的品质，其夹杂携带的病原菌还可能对国内经济作物造成潜在危害。经检验此病菌主要为链格孢菌。链格孢菌是半知菌暗色丝孢菌中重要的一类真菌，种属划分上为子囊菌座囊菌纲格孢腔菌目格孢腔菌科链格孢属。该属真菌种类多，在土壤、空气和农作物残体中均有分布，绝大多数种能兼性寄生在植物上，是常见的植物病原菌。植物病原菌是农作物的主要致病菌之一,它能引起包括玉米、小麦、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨等几十种农作物发病。链格孢除了引起农作物病害外，如日本梨黑斑病、烟草赤星病、番茄早疫病、马铃薯早疫病和柑橘幼苗萎黄病等还极易引起农产品霉变，导致蔬菜、瓜果和储存食品腐败变质。发生作物病害及食品腐败现象是由于病菌的代谢产物——毒素导致的。产生的植物毒素主要分为寄主专化性毒素(host-selectivetoxins，HSTs)和非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)菌株的采集；/n(2)菌株的培养；/n(3)分离菌种的DNA鉴定；/n(4)分离菌种的磷酸脂肪酸鉴定；/n(5)利用线性回归计算农作物携带链格孢菌的生物干重。/n

【技术特征摘要】
1.一种农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌株的采集；
(2)菌株的培养；
(3)分离菌种的DNA鉴定；
(4)分离菌种的磷酸脂肪酸鉴定；
(5)利用线性回归计算农作物携带链格孢菌的生物干重。


2.根据权利要求1所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中菌株的采集来自于小麦、玉米、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨中的一种或几种。


3.根据权利要求1所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中采集后的菌株接种于PDA琼脂固体平板培养基中培养经过2-4天，待其培养出菌落；然后将其分离纯化得到的菌株接种于PDA培养基，在培养箱中于25℃、黑暗条件下培养，观察两株菌的菌落的形态特点，待菌种生长起来后置于冰箱，温度为4℃中冷藏备用。


4.根据权利要求1所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中分离菌种的DNA鉴定步骤为：DNA提取→DNA浓度及纯度检测→PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳。


5.根据权利要求4所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增采用通用引物ITS1和ITS4对分离出的微生物的核糖体DNA转录间隔区进行了PCR扩增；通过对扩增产物进行测序，在NCBI数据库进行核酸搜索，获取同源细菌的序列，确定链格孢菌，纯化培养该菌株。


6.根据权利要求4所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中其中PCR的反应体系为：DNA模板×4μL；dNTPs为10mmol/L×1Ul；ITS1为10umol/L×2ul；ITS4为10umol/L×2ul；10×含MgCl2的Buffer×8Ul；Taq聚合酶1.0μL；RNaseFreeWater×32Ul；PCR反应过程为：94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸50秒，进行33个循环，最后72℃延伸10分钟。


7.根据权利要求1所述的农作物中链格...

【专利技术属性】
技术研发人员：李毅然，秦晋一，梁靓，薛佳欣，兰茜，郭佳琪，
申请(专利权)人：西安海关技术中心，
类型：发明
国别省市：陕西;61