利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，包括步骤为：用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体；用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，得到3’端为单链的DNA产物；将产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。通过上述方式，本发明专利技术能用于基因工程领域，特别是重组DNA的构建与氨基酸定点突变方面的应用，同时本方法也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗、基因克隆等领域。

Gene cloning using Du tolerant high fidelity DNA polymerase

【技术实现步骤摘要】
利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法
本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法。
技术介绍
基因克隆与氨基酸定点突变技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术首先利用限制性核酸内切酶消化目标基因DNA片段与质粒载体，然后DNA连接酶连接环化目标基因与质粒，形成完整的重组质粒。由于限制性核酸内切酶消化反应消化不完全，常常造成含有目标基因的阳性重组质粒百分比低于10%，甚至克隆失败。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。这些方法都依赖于目标基因与质粒载体DNA之间的重组反应，形成环状（带DNA缺口）质粒。其中基于尿嘧啶修饰引物和尿嘧啶DNA糖苷酶的基因克隆技术，是一种高效的连接酶非依赖型基因重组技术。尿嘧啶DNA糖苷酶能够使带尿嘧啶的DNA片段产生一定长度的单链DNA，从而使目的基因片段和载体二者之间在末端彼此配对，形成稳定的双链DNA区，即环状重组DNA。转化大肠杆菌后，该双链DNA区域的缺口会被大肠杆菌修复，最终形成完本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体，得到目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物；（2）将目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，使目标基因和质粒载体的两端产生12-30bp 单链同源区域；（3）将步骤（2）得到的产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标...

【技术特征摘要】
1.一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体，得到目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物；（2）将目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，使目标基因和质粒载体的两端产生12-30bp单链同源区域；（3）将步骤（2）得到的产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。


2.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述dU修饰引物的序列特征为：（a）扩增目标基因和质粒载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（b）扩增目标基因和质粒载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（c）引物长度40-50个碱基，3’端下游的18-25个碱基序列与目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对；（d）dU碱基位于1-30位碱基区，且每隔5-10个碱基为一个dU碱基。


3.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的DNA片段的正向引物、用于扩增质粒载体的DNA片段的正向引物、用于扩增目标基因的DNA片段的反向引物、用于扩增质粒载体的DNA片段的反向引物、目标核酸模板分子、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。


4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧，田文奇，
申请(专利权)人：苏州博睐恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32