热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，一种热敏型尿嘧啶‑DNA糖基化酶的制备方法，包括：将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列连入PTYB11载体得到表达载体，转入大肠杆菌进行表达纯化。本发明专利技术使用PTYB11载体作为表达载体，并对密码子进行了优化，获得大量的可溶性蛋白。PTYB11载体带有CBD标签，可使得后续的纯化过程变得更为容易。

【技术实现步骤摘要】
热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法。
技术介绍
热敏尿嘧啶-DNA糖基化酶(热敏UDG酶)的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，有缺失碱基的DNA链在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。热敏UDG酶在PCR防污染体系中具有非常重要的作用，因为PCR反应灵敏度高，环境中即使存在很微量的核酸也能被迅速扩增最后导致假阳性。为了防止模板被污染，目前比较好的方法是在PCR反应体系中加入UDG酶，用dUTP取代dTTP，这样即使污染DNA被扩增，所扩增出来的产物是含有dU的DNA链可以被UDG酶所特异性地消化掉，但UDG酶不会消化不含dUTP的DNA链。所以说，通过这种方式，第一轮产生的带有dUTP的PCR产物会被UDG酶降解，并在随后PCR变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，不会作为第二轮扩增的模板对PCR产生假阳性，从而保证扩增结果的特异性，准确性，同时在变性这一步，热敏UDG酶也会被灭活掉不会影响后续的反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种热敏型尿嘧啶‑DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，包括：将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列连入PTYB11载体得到表达载体，转入大肠杆菌进行表达纯化。

【技术特征摘要】
1.一种热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，包括：将SEQIDNO：2所示的核苷酸序列连入PTYB11载体得到表达载体，转入大肠杆菌进行表达纯化。2.根据权利要求1所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，以SEQIDNO：2所示的核苷酸序列为模板，SEQIDNO：11和12所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，将扩增产物连入PTYB11载体。3.根据权利要求1所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述表达的条件包括：将诱导后的大肠杆菌于14℃～16℃进行表达，表达时间为11h～13h。4.根据权利要求3所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述表达所用的培养基为LB培养基。5.根据权利要求1～4任一项所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法包括：依次使用Chitin柱、阴离子交换层析Q柱、阴离子交换SP柱对目的蛋白进行处理。6.根据权利要求8所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述PTYB...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟淑瑶，章瑞程，杨浩，
申请(专利权)人：广东菲鹏生物有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44