一种人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段TSPAN12-LEL制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术和基因工程技术领域，公开一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，包括将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列重组到质粒中构建重组表达质粒，然后将质粒转化至表达宿主中，诱导表达TSPAN12蛋白LEL片段，最后纯化得到TSPAN12蛋白LEL片段融合蛋白。本发明专利技术构建的蛋白表达体系提供了原核表达人源TSPAN12‑LEL的重组表达质粒构建方法，并将重组表达质粒转入表达宿主中构建了表达TSPAN12‑LEL的工程菌，通过诱导表达和纯化，获得高纯度可溶的TSPAN12‑LEL片段。本发明专利技术所采用的大肠杆菌表达系统具有表达效率高、表达量大、成本低等特点，并且可以实现TSPAN12‑LEL片段的高纯度可溶表达。

【技术实现步骤摘要】
一种人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段TSPAN12-LEL制备方法
本专利技术属于生物技术和基因工程
，涉及一种人源蛋白质的表达和纯化方法，特别涉及一种人源四次跨膜超家族蛋白12(Tetraspanin12，TSPAN12)的大胞外片段(largeextracellularloop，LEL)制备方法，简称TSPAN12-LEL制备方法，是人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段结构域的克隆和可溶表达。包括TSPAN12-LEL的表达和纯化方法。
技术介绍
TSPAN12是四次跨膜超家族蛋白(TransMembrane4SuperFamily，TM4SF)的成员之一，含4个跨膜结构域，将自身分为两个大小不等的胞外片段和一个胞内环及胞质中的N和C末端。TSPAN12全长共305个氨基酸，其中小胞外片段为26个氨基酸，大胞外片段有103个氨基酸，大胞外片段约占全长蛋白的三分之一。TSPAN12是Norrin/β-catenin信号通路的成员之一，在Norrin/β-catenin信号通路中，细胞膜上的卷曲蛋白4(Frizzled4，FZD4)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Low-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，包括将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列重组到质粒中构建重组表达质粒，然后将质粒转化至表达宿主中，诱导表达TSPAN12蛋白LEL片段，最后纯化得到TSPAN12蛋白LEL片段融合蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，包括将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列重组到质粒中构建重组表达质粒，然后将质粒转化至表达宿主中，诱导表达TSPAN12蛋白LEL片段，最后纯化得到TSPAN12蛋白LEL片段融合蛋白。2.根据权利要求1所述TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，包括重组表达质粒的构建、表达工程菌的构建、诱导表达和纯化；具体步骤如下：①克隆TSPAN12的LEL片段的编码序列，限制性内切酶酶切后插入到表达载体的多克隆位点中，经测序验证获得TSPAN12-LEL重组表达质粒；②将重组表达质粒转化至表达宿主中，通过筛选能可溶表达TSPAN12的LEL片段的菌株，获得TSPAN12-LEL表达工程菌；③将TSPAN12-LEL表达工程菌用培养基培养后，加入诱导剂诱导表达TSPAN12的LEL片段，表达结束后收获TSPAN12-LEL融合蛋白；④将收获的TSPAN12-LEL融合蛋蛋白用亲和层析和离子交换层析的方法纯化，得到高纯度、可溶的TSPAN12-LEL融合蛋白。3.根据权利要求1所述TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列；（2）将步骤（1）扩增出的片段和包含有麦芽糖结合蛋白编码序列的pMal质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16h；（3）将步骤（2）连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pMal质粒，从而获得TSPAN12LEL的重组表达质粒pMal-TSPAN12LEL；（4）将步骤（3）得到的重组表达质粒转化至表达宿主中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于36-38℃培养12-24h；挑取单菌落用LB培养基培养至光密度值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.1~1.0mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导表达；诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，离心15-20min收集菌体；（5）向步骤（4）所得菌体中加入相应体积的缓冲盐溶液，重新悬浮菌体，超声25-40min；超声结束后，冷冻离心25-40min，优选30min，收集蛋白上清液；（6）将步骤（5）所得蛋白上清液与交联直链淀粉树脂填充的层析柱结合后，用麦芽糖溶液洗脱层析柱，得到带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL粗提品，MBP-TSPAN12LEL；（7）将步骤（6）所得的MBP-TSPAN12LEL与阴离子交换柱结合后，用含有NaCl的缓冲盐溶液洗脱阴离子交换柱，收集含有MBP-TSPAN12LEL的流出液，得到高纯度的MBP-TSPAN12LEL。4.根据权利要求3所述TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，在步骤（3）和步骤（4）之间还可以包括步骤（8）至步骤（13）：（8）将步骤（3）得到的含有MBP和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组表达质粒pMal-TSPAN12LEL，经PCR扩增出MBP和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列MBP-TSPAN12LEL；（9）将步骤（8）扩增出的MBP-TSPAN12LEL编码序列和空白pETDuet-1质粒用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16h；（10）将步骤（9）的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证MBP-TSPAN12LEL编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点，得到表达带MBP标签的TSPAN12LEL片段的重组质粒，pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL；（11）将含有二硫键异构酶C编码序列的pET40b质粒，经PCR扩增出DsbC的编码序列；（12）将步骤（11）扩增出的DsbC的编码序列和步骤（10）得到的pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16h；（13）将步骤（12）的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证DsbC编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第二个多克隆位点，得到能稳定表达带MBP标签的TSPAN12LEL片段的重组表达质粒，pETDu...

【专利技术属性】
技术研发人员：串俊兰，杨正林，童荣生，张侯斌，黄璐琳，何霞，钟磊，张远，
申请(专利权)人：四川省人民医院，
类型：发明
国别省市：四川,51