一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂及其制备方法，属于生防菌剂制备技术领域；本发明专利技术所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，该生防菌剂配方内容为：1×10

A liquid biocontrol agent of Pichia mongolica and its preparation method

The invention discloses a liquid biocontrol agent of Pichia mongolica and its preparation method, belonging to the technical field of preparation of biocontrol agent; the liquid biocontrol agent of Pichia mongolica according to the invention comprises the following contents: 1*10

【技术实现步骤摘要】
一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂及其制备方法
本专利技术涉及一种季也蒙毕赤酵母菌（Pichiaguilliermondii）液体生防菌剂及其制备方法，属于生防菌剂制备

技术介绍
油桃、枇杷作为源于我国且栽培较广的水果之一，口味酸甜适度，且具有很高的营养价值。但是由于油桃、枇杷果实皮薄，成熟和采摘在高温高湿的初夏季节，在采摘、运销、贮藏过程中极易受到机械损伤和微生物侵害而发生腐烂，从而造成巨大的经济损失。炭疽病是多种果实采后运销和贮藏过程中常发生的主要病害之一，其病原微生物主要是胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichumacutatum）两种。一直以来，控制果实病害主要依赖于化学杀菌剂，目前由于消费者对食品质量要求的提高，以及对农药环境污染问题的关注，而使化学杀菌剂的应用受到部分限制，故亟待找到一种有效的果蔬病害防治的替代方法。近年来，生物防治已经成为各国关于果蔬采后病害防治的研究热点。其中拮抗酵母菌因为具有营养要求简单、易定植、繁殖快、环境抗逆性强等多种优点，而使其更适合作为生防制剂用于水果的采后病害防治方面，从而被认为可作为一种有效的代替化学合成杀菌剂的方法。但是目前对枇杷及油桃等炭疽病害具有显著防治作用的拮抗菌，报道不多，防治效果不明显。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂配方及其制备方法，以期应用于有效控制油桃、枇杷等果实运销、贮藏过程中发生的炭疽病害及腐烂问题。本专利技术首先提供一种季也蒙毕赤酵母Y35-1（PichiaguilliermondiiY35-1），已于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2016719。本专利技术还提供一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，该生防菌剂配方包括：1×106~1×109CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichiaguilliermondii）、2.5~7.5wt%海藻糖、0.01~0.03wt%谷胱甘肽、0.01~0.03wt%抗坏血酸、0.02~0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液。不同浓度间单因素实验结果若效果相似，则选用低浓度试剂。季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂优选的配方为：1×108CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichiaguilliermondii）、5%wt海藻糖、0.02wt%谷胱甘肽、0.01wt%抗坏血酸，以0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液配置。本专利技术同时也提供了一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂的制备方法，制备步骤如下：将季也蒙毕赤酵母菌活化后，取两环接种于NYDB种子培养基中（50mL/250mL），28℃、200r/min培养24h，取100μL种子培养液接入NYTB发酵培养基中（50mL/250mL），28℃、200r/min培养48h；将酵母菌发酵液置于离心杯中，3000r/min下离心10min，倒掉上清液，用无菌水清洗两次，所得沉淀用0.05mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）洗下并制成酵母菌悬液，用血球计数板计数，调整浓度后备用。用0.02~0.05mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）配制季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，使液体生防菌剂中含有1×106~1×109CFU/mL季也蒙毕赤酵母菌（Pichiaguilliermondii）、2.5~7.5%海藻糖、0.01~0.03%谷胱甘肽、0.01~0.03%抗坏血酸；充分混匀后，分装到已灭菌的离心管中，所分装的菌剂均分为3组，并分别保存在-20℃，5℃，25℃的条件下。按照本专利技术中的配方和制备方法配制的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，在5℃下存放，存活率较高，能较好保持菌剂的效力，具有较好的果实生防效果，为以后应用在油桃等果实贮藏方面提供了依据。本专利技术的有益效果描述如下：本专利技术提供了一种季也蒙毕赤酵母菌株Y35-1的液体生防菌剂极其制备方法；本专利技术筛选了多种保护添加剂，其中包括糖类（海藻糖）、抗逆及还原剂类（谷胱甘肽和抗坏血酸）。海藻糖因其在生物抗逆反应中的作用而被作为天然的保护剂，谷胱甘肽可以作为抗逆保护剂，抗坏血酸作为还原剂而具有抗逆保护作用，本专利技术选择选择的各保护添加剂和相应的用量下，拮抗酵母液体制剂的酵母菌存活率最高。按照本专利技术提供的制备方法制备的液体生防菌剂，虽然随着贮藏天数的增加，其存活率有所下降，但下降很缓慢，且相比较于对照组（25℃，10d，为70.5%；90d，<5.0%），其效果下降不明显，酵母菌存活率较高（25℃，10d，为88.2%；90d，为68.5%）。表明在制备液体生防菌剂时添加的海藻糖、谷胱甘肽等物质，对Y35-1酵母菌存活率的保持具有很好的保护作用。本专利技术所述的液体生防菌剂的适宜贮存条件为5℃，在相同贮藏天数时，存放的Y35-1液体生防菌剂的存活率在5℃（90d，66.5%）下要明显高于25℃对照组（90d，<5.0%），也高于-20℃低温（90d，35.5%）下存放的液体生防菌剂；本专利技术还对此液体生防菌剂的果实生防效果进行了验证，结果显示Y35-1酵母菌液体菌剂处理的油桃果实21d发病率（16.0%）与果实病斑直径（0.50cm）均比对照组（100%，3.50cm）中的明显减少，且与之存在显著性差异。Y35-1酵母菌液体菌剂处理的枇杷果实21d发病率（15.6%）与果实病斑直径（0.35cm）也比对照组（100%，3.10cm）中的明显减少。结果显示本专利技术配制的液体制剂能有效抑制油桃、枇杷果实中的炭疽病病害的发生与发展。附图说明图1本专利技术的季也蒙毕赤酵母菌Y35-1菌株的细胞及菌落形态学特征。图2本专利技术的季也蒙毕赤酵母菌Y35-1菌株的PCR结果（a）及系统发育树（b）；图中，M为DL2000PlusDNAMarker，1为菌株Y35-1的PCR产物。图3是本专利技术提供的季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂在25℃、5℃、-20℃下存放的酵母菌细胞存活率统计结果。具体实施方式通过借助以下实施实例将更加详细地说明本专利技术。此处所描述的具体实施实例仅具有说明性，本专利技术并不受这些实施实例的限制。实施例1：菌株的分离及鉴定季也蒙毕赤酵母菌Y35-1（PichiaguilliermondiiY35-1）是本实验室筛选得到的，经验证，其抑菌效果非常好。已于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCCNO:M2016719）。菌种筛选及鉴定过程主要步骤如下：拮抗酵母菌的分离：从镇江市高桥镇农业生态果园采集成熟健康枇杷果实，在完整果实表面分离筛选菌株，挑选培养特征各异的酵母单菌落在NYDA平板上进行分离纯化，挑取各个单菌落进行低温保藏。拮抗酵母菌悬液制备：将培养的酵母菌重悬浮成为菌悬液，用血球计数板计算酵母菌悬液的浓度，用无菌蒸馏水调整菌悬液至所需浓度，备用。通过体内和体外的多次筛选，最终得到一株具有抑菌作用且活性强的拮抗酵母菌株，并对该菌株进行种属的鉴定。拮抗酵母菌的体外筛选：挑选培养板中挑选抑菌效果良好，即具有生防潜力的酵母菌株做体内筛选。拮抗酵母菌的体内筛选：根据果实的腐烂情况，挑选出具有抑菌作用的酵母菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种防治果实炭疽病的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35‑1，于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2016719。

【技术特征摘要】
1.一种防治果实炭疽病的季也蒙毕赤酵母（Pichiaguilliermondii）Y35-1，于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016719。2.一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂包括权利要求1所述的季也蒙毕赤酵母（Pichiaguilliermondii）Y35-1，所述季也蒙毕赤酵母（Pichiaguilliermondii）Y35-1的浓度为1×106~1×109CFU/mL。3.根据权利要求2所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，其特征在于，所述季也蒙毕赤酵母（Pichiaguilliermondii）Y35-1的浓度为1×108CFU/mL。4.根据权利要求2所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂还包括质量浓度为2.5~7.5%的海藻糖、质量浓度为0.01~0.03%谷胱甘肽、质量浓度为0.01~0.03%抗坏血酸、0.02~0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液。5.根据权利要求4所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂还包括质量浓度为5%的海藻糖、质量浓度为0.02%的谷胱甘肽、质量浓度为0.01%的抗坏血酸、0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液。6.权利要求1-5任一项所述的一种季也蒙毕赤酵母菌液体生防菌剂的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙卫红，周秋阳，杨慧慧，王玲，郑鸿儒，温新宇，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32