本发明专利技术提供一种双特异性抗体，其包含抗MUC1 VHH的抗体片段和抗CD16 VHH的抗体片段。本发明专利技术使用的抗体片段为来自骆驼重链抗体的可变区序列，与抗原具有高结合亲和性。本发明专利技术将识别MUC1和识别CD16的抗体片段构建在同一抗体分子中，可以特异性结合MUC1和CD16分子，促进NK细胞对MUC1阳性表达细胞的杀伤作用，对MUC1阳性肿瘤的生长起到抑制的作用。本发明专利技术还提供所述双特异性抗体的偶联物、相关的药物组合物和应用。
【技术实现步骤摘要】
用于肿瘤治疗的双特异性抗体和抗体偶联物及其应用
本专利技术涉及一种双特异性抗体及其制备，更具体地，涉及抗MUC1和抗CD16的双特异性抗体，用于肿瘤治疗领域。
技术介绍
肿瘤免疫治疗中，双特异抗体(bispecificantibody,bsAb)在其中起到了非常重要的作用。双特异抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，通过结合位点，可同时结合效应细胞与靶细胞表面的特异性抗原，激活静止状态的效应细胞并募集到靶细胞周围，介导靶细胞的凋亡或裂解。已开发出多种靶向不同免疫效应细胞和肿瘤细胞的bsAb，其中在肿瘤免疫治疗中的主要免疫效应细胞为T细胞、NK细胞和巨噬细胞等。NK细胞和T细胞是目前研究较多的效应细胞。在T细胞表面具有引发作用的分子，包括CD2、CD3、CD28等，因此在构建用于肿瘤治疗的双特异抗体时，通常都包括识别这些分子的特异性，其中基于CD3和CD28的双特异抗体研究较多。BiTE(双特异T细胞募集者)是一种双特异抗体的形式，能通过抗CD3的单链抗体片段最大程度的介导T靠近肿瘤细胞，进而发挥裂解肿瘤的作用。当前，有几种靶向BiTE正在研发之中，比如CD19(针对B细胞癌)、上皮细胞粘附分子(EpCAM，CD326)，前列腺特异膜抗原(PSMA)，以及MUC1。MEDI-565，又名MT111或AMG211，是一种BiTE抗体，能介导T细胞杀伤表达MUC1的肿瘤细胞，且与肿瘤细胞系的突变状态无关。现在该药物正处于临床I期实验(ClinicalTrails.gov,NCT02291614)中，用于治疗晚期结肠腺癌。虽然取得了这些进步，但是双特异抗体主要的挑战仍然存在，例如提高制造效率，保留免疫原性，降低毒性，和增加半衰期。自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)是体内免疫中的重要组成部分，在天然免疫中识别外界抗原，进而直接清除。其杀伤作用具有MHC非限制性，多种肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用敏感。其表面特异性分子CD16，是一种分布于NK细胞，中性粒细胞和单核细胞、巨噬细胞等表面的低亲和力Fc受体。CD16通过结合IgG的Fc区域，可以激活NK细胞产生ADCC。bsAb分子上的抗CD16抗体结合位点，可以在两个方面增加NK细胞基础上的免疫治疗作用：(1)作为肿瘤部位的锚定分子，募集NK细胞，使得局部NK细胞数量增加，延长肿瘤细胞与NK的接触时间，增强NK细胞的杀伤作用；(2)在肿瘤部位激活NK细胞，进而杀伤肿瘤细。目前已有多种结合CD16与肿瘤相关抗原的双特异抗体在研究之中，比如靶向Her2的乳腺癌，CD33，CD20等。其中靶向CD30和CD16的双特异抗体AFM13，用于治疗顽固性和/或再发性霍奇金淋巴瘤已经进入临床试验(clinicaltrials.govidentifier:NCT01221571)。MUC1是Mucins黏蛋白家族成员，存在正常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细胞表面,由多肽核芯(核芯肽)和侧枝糖链构成。其核芯肽胞外段含有许多20个氨基酸(SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT)的串联重复序列(vriablenumberstandemrepeats,VNTRs)。正常组织MUC1与肿瘤组织不同，前者分布于腺管上皮细胞分泌极，与免疫细胞相对隔离，糖基化丰富；而后者广泛分布并异常丰富地表达于癌细胞表面,糖基化不完全，因此暴露出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻击的靶点。MUC1核芯肽的PDTRP表位既能被多种MUC1抗体识别，也可被CTL细胞识别和杀伤。另外，双特异性抗体可能具有较差的药代动力学和物理性质(诸如免疫原性)以及和制造上的困难。因此，需要对这样的现有技术的改善或替代技术。
技术实现思路
本专利技术提供一种双特异性抗体，其包含抗MUC1VHH的抗体片段和抗CD16VHH的抗体片段，其中所述抗MUC1VHH的抗体片段，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述抗CD16VHH的抗体片段，其氨基酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。在一些实施方式中，所述双特异性抗体中的抗MUC1VHH的抗体片段和抗CD16VHH的抗体片段之间是通过连接肽序列连接而成的。在一些实施方式中，所述连接肽序列的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。在一些实施方式中，所述双特异性抗体中的抗MUC1VHH的抗体片段和抗CD16VHH的抗体片段之间的连接方式为：抗MUC1VHH-连接肽-抗CD16VHH。在另一些实施方式中，所述双特异性抗体中的抗MUC1VHH的抗体片段和抗CD16VHH的抗体片段之间的连接方式为：抗CD16VHH-连接肽-抗MUC1VHH。本专利技术另一方面提供一种药物组合物，其包含本专利技术所述的双特异性抗体以及药学上可接受的附加剂，所述附加剂包括载体、稳定剂和/或赋形剂。本专利技术另一方面提供一种编码本专利技术所述双特异性抗体的核苷酸序列、包含所述核苷酸序列的表达载体、或用所述表达载体转化或转染的宿主。本专利技术另一方面还提供一种治疗患有癌症的对象方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本专利技术所述的双特异性抗体或其药物组合物。本专利技术另一方面还提供本专利技术所述的双特异性抗体在制备治疗癌症的药物中的应用。本专利技术的再一方面提供一种抗体偶联物，其包含偶联于纳米材料(例如为纳米微粒)上的如上所述的双特异性抗体。所述纳米微粒可以为生物可降解纳米材料，优选为聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸、聚己内酯、聚丁二醇丁二酸酯、聚苯胺、聚碳酸酯、乙丙交酯共聚物或乙交酯己内酯共聚物中的任意一种或至少两种的混合物，更优选为聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸和/或聚己内酯。本专利技术的再一方面提供一种药物组合物，其包含本专利技术所述的抗体偶联物。所述药物组合物还可以包含细胞毒性效应细胞。所述细胞毒性效应细胞优选为白细胞，选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞，优选为包含选自T细胞和NK细胞的细胞毒性效应细胞。所述药物组合物优选用于免疫治疗。本专利技术的再一方面还提供一种治疗患有癌症的对象方法，所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本专利技术所述的抗体偶联物或其药物组合物。本专利技术的再一方面还提供本专利技术所述的抗体偶联物在制备治疗癌症的药物中的应用。本专利技术提供的一种抗MUC1-CD16的双特异抗体，由抗CD16和抗MUC1的纳米抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性地与这两者结合，引导NK细胞靠近MUC1表达阳性细胞，进而通过ADCC效应，杀伤或抑制肿瘤的生长。本专利技术使用的抗体片段为来自骆驼重链抗体的可变区序列，与抗原具有高结合亲和性。本专利技术将识别MUC1和识别CD16的抗体片段构建在同一抗体分子中，可以特异性结合MUC1和CD16分子，促进NK细胞对MUC1阳性表达细胞的杀伤作用，对MUC1阳性肿瘤的生长起到抑制的作用。该分子能在原核表达系统中可溶性表达，有利于后续的分离纯化。该分子具有较好的热稳定性和高度可溶性。本专利技术使用的纳米抗体序列与人免疫球蛋白的众链可变区序列具有较高的同源性，抗原性弱。此外，本专利技术提供的双特异性抗体都已被人源化。附图说明图1：抗CD16-MUC1双特异纳米抗体的结构示意图。图2：抗MUC1-抗CD16抗体的纯化电泳图。图3：流式细胞术检测双特异抗体可结合肿瘤细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双特异性抗体，其包含抗MUC1VHH的抗体片段和抗CD16VHH的抗体片段，其中所述抗MUC1VHH的抗体片段，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述抗CD16VHH的抗体片段，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体，其包含抗MUC1VHH的抗体片段和抗CD16VHH的抗体片段，其中所述抗MUC1VHH的抗体片段，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述抗CD16VHH的抗体片段，其氨基酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中抗MUC1VHH的抗体片段和抗CD16VHH的抗体片段之间是通过连接肽序列连接而成的。3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述连接肽序列的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。4.根据权利要求2或3所述的双特异性抗体，其中抗MUC1VHH的抗体片段和抗CD16VHH的...
【专利技术属性】
技术研发人员：于浩洋，王忠，李正成，
申请(专利权)人：本康生物制药深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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