抗PD-1-抗VEGFA的双功能抗体、其药物组合物及其用途制造技术

本发明专利技术属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及抗VEGFA‑抗PD‑1双功能抗体、其药物组合物及其用途。具体地，所述的抗VEGFA和PD‑1的双功能抗体，其包括：靶向VEGFA的第一蛋白功能区，和靶向PD‑1的第二蛋白功能区。本发明专利技术的双功能抗体能够特异性地与VEGFA和PD‑1结合，特异地解除VEGFA和PD‑1对机体的免疫抑制，同时抑制肿瘤引起的血管发生，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
抗PD-1-抗VEGFA的双功能抗体、其药物组合物及其用途
本专利技术属于肿瘤治疗和免疫学生物学领域，涉及一种抗PD-1-抗VEGFA的双功能抗体、其药物组合及其用途。具体地，本专利技术涉及一种抗人PD-1-抗人VEGFA的双功能抗体、其药物组合及其用途。
技术介绍
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过1－2mm，转移则无法实现。血管内皮生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。VEGF家族包括：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和PIGF。血管内皮生长因子受体(VEGFR)包括VEGFR1(又称Flt1)、VEGFR2(又称KDR或Flk1)、VEGFR3(又称Flt4)和Neuropilin-1(NRP-1)。其中，前三种受体在结构上类似，都属于酪氨酸激酶超家族，均由膜外区、跨膜片段及膜内区三部分构成，其中膜外区由免疫球蛋白样结构域组成，膜内区属酪氨酸激酶区。VEGFR1和VEGFR2主要位于血管内皮细胞表面，VEGFR3主要位于淋巴管内皮细胞表面。VEGF家族分子对于几种受体有不同的亲和力。VEGFA主要与VEGFR1、VEGFR2和NRP-1结合发挥作用。VEGFR1是最早发现的受体，在正常生理情况下VEGFR1与VEGFA的亲和力比VEGFR2与VEGFA的亲和力高，但是其胞内段酪氨酸酶活性比VEGFR2低(马莉，中国优生与遗传杂志，24(5)：146-148(2016))。VEGFR2是血管发生和构建的主要调节者，与VEGFR1相比VEGFR-2具有很高的酪氨酸激酶活。VEGFR2与配体VEGFA结合后介导血管内皮细胞的增殖、分化等行为，以及血管的形成过程和血管的通透性(RoskoskiRJr.等人，CritRevOncolHematol，62(3)：179-213.(2007))，VEGFA与VEGFR2结合后通过下游PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK信号传导通路介导胞内相关蛋白基因转录表达，促进血管内皮细胞增殖(TakahashiT等人，Oncogene，18(13)：2221-2230.(1999))。VEGFR3属于酪氨酸激酶家族成员之一，主要表达在胚胎时期的血管内皮细胞和成年期的淋巴管内皮细胞，VEGFC和VEGFD与VEGFR3结合以刺激淋巴管内皮细胞的增殖与迁移，促进淋巴管的新生；NRP-1是一种非酪氨酸激酶跨膜蛋白，不能独立转导生物信号，而与VEGF酪氨酸激酶受体形成复合物后才能介导信号传导。(马莉，中国优生与遗传杂志，24(5)：146-148(2016))。VEGFA与VEGFR2主要参与调控血管生成，VEGFA与VEGFR2结合前后会引发上下游通路中众多中间信号形成级联反应，最终以内皮细胞增殖、存活、迁移、通透性增加及浸润到周围组织等不同形式改变其生理功能(董宏超等人，《现代肿瘤医学》，2014年9月第22卷，第9期，第2231-3页)。目前已经有多种靶向人VEGF特别是VEGFA的人源化单克隆抗体，如贝伐单抗(Bevacizumab)，其于2004年期间陆续被美国食品药品管理局批准用于治疗非小细胞肺癌、肾细胞癌、宫颈癌、转移性结直肠癌等多种肿瘤。细胞程序性死亡受体-1(Programmedcelldeathprotein，PD-1),又被称为CD279，是I型跨膜糖蛋白膜表面受体，属于CD28免疫球蛋白超家族，表普遍达于T细胞，B细胞以及髓样细胞都。PD-1有两个天然配体，PD-L1和PD-L2。PD-L1和PD-L2均属于B7超家族，组成性地或诱导性地表达于多种细胞膜表面，包括非造血系统细胞以及多种肿瘤细。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、DC以及微血管内皮细胞和多种肿瘤细胞。PD-L2则仅表达于抗原呈递细胞如树突状细胞和巨噬细胞。PD-1与其配体的相互作用可抑制淋巴的活化，抑制T细胞的增殖以及IL-2、IFN-γ等细胞因子的分泌。有大量研究表明肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受免疫细胞的破坏，而肿瘤微环境中浸润的淋巴细胞PD-1表达上调，且多种原发肿瘤组织在免疫组化分析中均表现为PD-L1阳性，如肺癌、肝癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、胶质瘤等。同时，PD-L1在肿瘤的表达与癌症患者的不良预后显著相关。阻断PD-1与其配体的相互作用可促进肿瘤特异性的T细胞免疫，提高肿瘤细胞的免疫清除效率。大量临床试验表明，靶向PD-1或PD-L1的抗体可促进CD8+T细胞浸润到肿瘤组织，上调抗肿瘤的免疫效应因子，如IL-2、IFN-γ，颗粒酶B以及穿孔素，从而有效抑制肿瘤的生长。此外，抗PD-1的抗体还可用于治疗病毒慢性感染。病毒慢性感染往往伴随着病毒特异性的效应T细胞功能丧失和数量的减少。通过注射PD-1抗体可阻断PD-1和PD-L1的相互作用，从而有效抑制效应T细胞在病毒慢性感染中的耗竭。由于PD-1抗体的广谱抗肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对PD-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌，肾细胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(HometM.B.,ParisiG.,etal.,Anti-PD-1TherapyinMelanoma.SeminOncol.2015Jun；42(3):466-473)，淋巴瘤以及贫血(HeldSA,HeineA,etal.,AdvancesinimmunotherapyofchronicmyeloidleukemiaCML.CurrCancerDrugTargets.2013Sep；13(7):768-74)。在2012年和2013年的美国癌症协会(AACR)年会以及美国临床肿瘤协会(ASCO)年会上揭晓的前所未有的临床药效数据后，既成为全球制药行业最炙手可热的在研新药。双功能抗体亦称为双特异性抗体(BispecificAntibody)，是同时靶向两种不同抗原的特异性药物，其可通过免疫分选纯化生产。另外，也可通过基因工程获得，基因工程在结合位点优化，合成形式的考量以及产量等方面都具有相应的灵活性，所以具有一定的优势。目前，其存在形式已被证明有超过45种(Konter本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双特异性抗体，其包括：靶向VEGFA的第一蛋白功能区，和靶向PD‑1的第二蛋白功能区；其中：所述第一蛋白功能区为抗VEGFA的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗VEGFA的抗体的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15－SEQ ID NO:17所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18－SEQ ID NO:20所示的LCDR1‑LCDR3；和所述第二蛋白功能区为抗PD‑1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗PD‑1的抗体的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:21－23所示的HCDR1－HCDR3，并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:24－26所示的LCDR1－LCDR3。

【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体，其包括：靶向VEGFA的第一蛋白功能区，和靶向PD-1的第二蛋白功能区；其中：所述第一蛋白功能区为抗VEGFA的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗VEGFA的抗体的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:15－SEQIDNO:17所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:18－SEQIDNO:20所示的LCDR1-LCDR3；和所述第二蛋白功能区为抗PD-1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗PD-1的抗体的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:21－23所示的HCDR1－HCDR3，并且其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:24－26所示的LCDR1－LCDR3。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述抗VEGFA的抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体；和/或，所述抗PD-1的抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:15－17的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:18－20的LCDR1－LCDR3；和所述第二蛋白功能区为单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:21－23所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:24－26所示的LCDR1－LCDR3；或者，所述第一蛋白功能区为单链抗体，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:21－23所示的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:24－26所示的LCDR1－LCDR3；和所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，其重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:15－17的HCDR1－HCDR3，其轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQIDNO:18－20的LCDR1－LCDR3。4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示；和所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示；或者，所述免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示；所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示；和重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，所述免疫球蛋白的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。5.根据权利要求3或4所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白为IgG、IgA、IgD、IgE或IgM；优选为IgG。6.根据权利要求3或4所述的双特异性抗体，其中，所述单链抗体为两条，每条单链抗体的一端分别连接在免疫球蛋白的两条重链的C末端或N末端。7.根据权利要求3或4所述的双特异性抗体，其中，所述的免疫球蛋白包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。8.根据权利要求3或4所述的双特异性抗体，其中，所述的免疫球蛋白，其恒定区来自人抗体；优选地，所述免疫球蛋白的恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。9.根据权利要求3或4所述的双特异性抗体，其中，所述的免疫球蛋白，其重链恒定区为人Iggamma-1chainCregion或人Iggamma-4chainCregion，并且其轻链恒定区为人IgkappachainCregion...

【专利技术属性】
技术研发人员：李百勇，夏瑜，王忠民，张鹏，
申请(专利权)人：中山康方生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44