新细菌制造技术

本发明专利技术涉及不受普通噬菌体攻击的新型乳杆菌属菌株和具有提高的细胞计数稳定性的新颖乳杆菌属菌株，其在制造基于发酵乳的产品中的用途，以及含有所述菌株的新颖基于乳的产品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新细菌
本专利技术涉及不受普通噬菌体攻击的新颖乳杆菌属(Lactobacillus)菌株，其在制造基于发酵乳的产品中的用途，以及含有所述菌株的新颖基于乳的产品。在相关方面，本专利技术涉及改善乳酸杆菌例如副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的细胞计数稳定性的方法。
技术介绍
发酵乳产品，例如发酵乳饮品、乳酸菌饮料、酸奶、培养乳和奶酪等，经常通常通过提供乳基质，特别是基于动物乳，例如牛乳、山羊乳、羊乳等的乳基质作为培养基，并用乳酸菌使培养基发酵来产生。在生产发酵乳产品的过程中，噬菌体可能攻击细菌，导致乳酸菌活细胞数减少。特别是作为具有生理效果例如肠功能控制效果和免疫增强效果的保健食品而消费的发酵乳产品依赖于大量活细菌。包含副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)或干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的益生菌的发酵乳产品的生产，经常在乳品厂中受到噬菌体攻击的挑战，导致产品的活细菌含量降低。例如，副干酪乳杆菌LC-01(CHCC2115)菌株在不同的乳品厂中被噬菌体反复攻击。然而，难以用相同物种的另一菌株替换易受噬菌体攻击的菌株，因为替代菌株很少具有类似的功能，例如酸化活性、风味特征和/或相同的益生菌特征。已经建议获得噬菌体抗性菌株，并且教导了获得抗噬菌体干酪乳杆菌菌株的方法：JP1341782C3公开了通过从菌株YIT-9018(FERM-PNo.4751)中除去原噬菌体而获得的干酪乳杆菌YIT-9029(FERM-PNo.5852)菌株。日本专利19861005712B4公开了通过诱变处理从具有原噬菌体FSW的干酪乳杆菌(例如干酪乳杆菌YIT-9018)中分离温度敏感性突变体，并通过热诱导方法从菌株中除去原噬菌体FSW来获得抗溶菌作用的细菌菌株。但是，这些方法似乎只对含有原噬菌体的菌株有效。同时，最近对活细菌的健康相关有益效果以及延长的保质期的关注导致对具有延长的活力例如改善的细胞计数稳定性的乳酸菌的更高要求。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供获得副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌菌株的噬菌体抗性突变体，以及副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌菌株的细胞计数稳定性增强的突变体的方法。本专利技术人已经发现，与噬菌体挑战和筛选组合的诱变产生了可以代替发酵乳饮料中的母株的噬菌体抗性菌株。令人惊讶的是，本专利技术人发现突变菌株与母株相比具有改善的性质，因为与用母株生产的发酵乳相比，发现用本专利技术菌株发酵的乳具有明显更低的沉淀程度。这减少了向发酵乳制品中添加稳定剂和/或增稠剂的需要。此外，在密切相关的方面，本专利技术人开发了改善乳杆菌细胞计数稳定性的方法，并且发现了表现出改善的细胞计数稳定性的新菌株。更具体而言，本专利技术人发现，通过修改编码糖基转移酶(通过截短)和涉及O-抗原和磷壁酸(RfbX)输出的膜蛋白的基因，可以获得细胞计数稳定性改善的突变体。更具体而言，细胞计数稳定性改善的突变体具有一个核苷酸C缺失(CHCC2115参考基因的位置202)，导致截短的糖基转移酶基因，并且在与干酪乳杆菌BL23的eps7M具有同源性的基因中具有突变，也见于CHCC19844。eps7M的基因产物是细胞壁多糖基因簇的一部分。基因比较还显示了与“涉及O-抗原和磷壁酸(RfbX)输出的膜蛋白”的同源性。eps7M同源物位于糖基转移酶下游三个基因处。两个突变都在同一区域。基于与涉及cps产生的基因的同源性，显然所鉴定的突变是噬菌体抗性表型的原因。细胞计数被稳定的菌株CHCC19845具有双突变，除了修饰的膜蛋白外，它还具有截短的糖基转移酶，并且两种突变都位于相同的细胞壁多糖操纵子中。令人惊讶地发现，这个基因簇中的双突变事件导致非凡的噬菌体抗性以及增强的细胞计数稳定性。定义在本文中，术语“抗噬菌体”是指乳酸菌菌株能够在每毫升含有1000个噬菌体的乳中繁殖(在最佳生长温度下)，即该细菌在以10E5cfu/ml的浓度接种48小时后能够达到超过10E8的细胞密度。Cfu是“细胞形成单位”。术语“细胞计数稳定性”应理解为每克产物的菌落形成单位(CFU)的量的量度。随着时间的推移，乳杆菌CFU/g越高，测试菌株的细胞计数越稳定。可以使用倾注培养法测量细胞计数稳定性。术语“基本上无活性的”应针对本专利技术的目的来理解，其中所述目的是(基本上)使编码噬菌体受体蛋白的基因例如eps7M基因失活。目的是制备这样的菌株，在所述菌株中，噬菌体受体蛋白与在相应的亲本菌株或野生型菌株中相比显著更差地作用。如下文所解释的，对技术人员而言，制备这样的菌株是常规工作。例如，通过在噬菌体受体基因中引入终止密码子或移码插入，可以产生例如不表达噬菌体受体蛋白或表达部分长度的无活性噬菌体受体蛋白的非功能性基因。或者，可以在启动子或基因中进行突变，这可以产生例如具有一些活性，但是对于所有本文相关实际目的而言基本上是无活性的噬菌体受体蛋白突变变体。测量噬菌体受体蛋白无活性的方法简单地是分析细菌对合适代表性组的不同噬菌体的的增强的抗性。如下文所解释的，这是技术人员的常规工作，并且如果如本文所述的细菌对所述组的噬菌体具有显著增强的抗性，则在本文中应理解，所述噬菌体受体蛋白是基本上无活性的。噬菌体受体蛋白的失活通常不会负面影响LAB的活力、生长速率或酸产生。参见本文的工作实施例，其中对两种不同菌株证明了这一点。涉及噬菌体抗性的其他基因可以根据上述方法(基本上)失活。表述“噬菌体受体蛋白关于噬菌体感染是功能上无活性的”是指这样的噬菌体受体蛋白，其不同于噬菌体受体蛋白序列SEQIDNo.2，并且其特征在于携带编码所述功能上无活性的噬菌体受体蛋白的噬菌体受体基因的细菌对至少一种噬菌体，特别是对噬菌体CHPC1256具有提高的抗性。术语“对噬菌体的提高的抗性”表示，当在空斑测定中，例如下文所述的测定“通过琼脂覆盖法测定噬菌体抗性”中测试时，细菌菌株对至少一种噬菌体具有提高的噬菌体抗性，表示为在给定的菌株上用所述至少一种噬菌体可获得的pfu/ml(空斑形成单位/ml)的差异，相比于在亲本菌株上用相同噬菌体可获得的pfu/ml。具有对噬菌体提高的抗性的菌株显示至少50倍，例如至少100倍，例如500倍，优选至少1000倍，更优选至少10000倍或更多倍的pfu/ml降低。使噬菌体受体蛋白基本上失活的方法如上所述，制备如本文所述的菌株是本领域技术人员的常规工作，其中噬菌体受体蛋白是基本上无活性的。通常来说，合适的常规方法可以通过同源重组将合适的DNA片段引入或替换到噬菌体受体基因组基因序列中(例如通过使用公众可获得的pGhost载体)。如果引入的片段例如包含无义(终止)密码子，那么该基因将会失活，并且LAB将会是具有无活性噬菌体受体蛋白的LAB。另一种合适的修饰可以是移码突变、缺失、突变或插入。或者，可以将合适的修饰引入相关区域，例如启动子区域。如上所述，对噬菌体受体基因的合适修饰可以是许多事物，例如终止密码子、引起例如移码的插入、缺失、启动子突变、突变等。选择适当策略以例如引入对噬菌体受体基因的合适修饰以便不表达活性噬菌体受体蛋白是技术人员的常规工作。或者，可以随机诱变(例如通过UV辐射或化学诱变)并选择其中噬菌体受体蛋白基本上无活性的突变。还可以选择相关的自发突变，其中噬本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.物种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的菌株，所述菌株对作为DSM32286保藏的噬菌体CHPC1256或该噬菌体的突变体或变体的感染具有抗性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.15 EP 16165621.0;2016.05.11 EP 16169151.41.物种副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)或干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的菌株，所述菌株对作为DSM32286保藏的噬菌体CHPC1256或该噬菌体的突变体或变体的感染具有抗性。2.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，当在发酵乳基质中在5摄氏度下储存40天时，所述菌株保持至少75％，例如80％、85％、90％或96％的活力。3.根据权利要求2所述的菌株，其中所述菌株以约109CFU/kg乳的比率接种，并任选地作为单一酸化剂。4.根据权利要求1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株在基因eps7M中具有突变，所述突变导致所编码蛋白质的结构中的变化和/或所述菌株在编码糖基转移酶的基因LCABL_02330中具有突变(例如导致截短)，所述突变导致具有糖基转移酶活性的酶部分或完全失活。5.通过包括以下步骤的方法可获得的菌株：-使副干酪乳杆菌菌株LC-01(DSM19465)经历诱变；-将突变的菌株暴露于噬菌体CHPC1256(DSM32286)；-选择对所述噬菌体CHPC1256具有抗性的菌株。6.作为DSM32276保藏的菌株副干酪乳杆菌CHCC19845，及其具有相同(或基本上相同)或提高的功能性的突变体，所述功能性例如关于噬菌体抗性或沉淀或细胞计数稳定性。7.物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株，所述菌株在基因eps7M中具有突变，所述突变导致所编码蛋白质的结构中的变化。8.一种用于制备物种副干酪乳杆菌或干酪乳杆菌的菌株的噬菌体抗性突变体的方法，所述方法包括：-使所述菌株(母菌株)的培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·简森，S·布洛赫，
申请(专利权)人：科·汉森有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK