本发明专利技术提供一种表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本发明专利技术提供表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF(其保藏号为CGMCC?No.5401)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本专利技术提供表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa_NiVF (其保藏号为CGMCC No. 5401)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。
技术介绍
尼帕病脑炎是一种高度烈性人畜共患传染病，其病原尼帕病毒属于副粘病毒科， 亨尼帕病毒属，同属的只有亨德拉病毒。尼帕病毒宿主范围非常广泛，其中猪是重要的易感动物。尼帕病毒的自然宿主为果蝠。该病于1998年9月下旬至1999年6月中旬于马来西亚首次爆发，发病例数高达265例，死亡105例，死亡率为38.5%。为了控制疾病的蔓延，马来西亚政府屠杀了一百多万头猪，占该国养猪量40%。此后，该病又在印度、孟加拉等国陆续发生，而本病的致死率也呈现上升趋势(67% -92% ) 。尼帕病毒给这些国家的畜牧业发展和人民健康造成了严重危害。我国目前虽然没有该病爆发，但其已经对我国构成了巨大威胁。果蝠在东南亚地区广泛分布，在我国南方地区分布较多，国内已有学者从我国南方地区的蝙蝠当中检测到了尼帕病毒抗体的存在W]。由于我国周边多个国家爆发该病，伴随着贸易往来的不断加深该病传入我国的压力也不断增大。且我国养猪数量极大，养猪业已成为我国农业的重要支柱性产业之一，因此该病一旦爆发势必会对我国的养猪业及人民群众的正常生活和生命安全造成严重危害，防控形势不容乐观。因此，储备可以有效防控尼帕病毒的疫苗具有非常重要的战略意义。尼帕病毒的融合蛋白(F蛋白)是位于病毒粒子表面的I型跨膜糖蛋白，其主要功能是介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，从而使病毒基因组进入细胞。F蛋白是尼帕病毒的主要免疫保护性抗原，是诱导机体产生CTL(杀伤性T细胞)免疫反应的主要结构蛋白。 F蛋白也能使免疫动物产生中和抗体。本研究利用新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统成功构建了表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒活载体疫苗-rLa-NiVF，并在小鼠和猪体内对rLa-NiVF的免疫效果进行了评价，证明此疫苗可以诱导机体产生良好的细胞和体液免疫反应，是防控尼帕脑炎病毒的优秀的候选疫苗，在我国应对尼帕病毒的潜在威胁中显示了良好的应用前景，因而具有重要的战略意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本专利技术提供表达尼帕脑炎病毒F蛋白的重组新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa-NiVF (其保藏号为CGMCC No. 5401)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。具体地，本专利技术成功构建了表达尼帕病毒(Nipah virus，NiV)F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF (该疫苗株于2011年10月沈日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国北京，中国科学院微生物研究所，100101)，并在小鼠和断奶仔猪上系统评价了所述重组病毒产生的体液和细胞免疫反应。本专利技术采用新城疫病毒LaSota弱毒株反向遗传操作系统构建了表达尼帕病毒F 蛋白的重组新城疫病毒rLa-NiVF。用间接免疫荧光和特异性细胞融合实验证实尼帕病毒 F蛋白的表达；将所述重组病毒免疫小鼠，用酶联免疫吸附试验(ELISA)和水泡性口炎病毒囊膜嵌合尼帕脑炎病毒G/F蛋白伪型病毒粒子做中和试验(VNA)以检测重组病毒诱导的体液免疫水平；用流式细胞术(FACQ评价重组病毒产生的特异性细胞免疫。以rLa-NiVF免疫断奶仔猪并检测中和抗体水平。结果显示，rLa-NiVF能够正确表达尼帕病毒F蛋白。将重组病毒免疫Balb/c小鼠，ELISA表明免疫组小鼠可产生特异性IgG，病毒中和试验显示免疫小鼠可以产生针对尼帕病毒的中和抗体；流式细胞术表明免疫组小鼠能够产生高水平的 F蛋白特异性CD8细胞免疫反应。猪免疫试验表明，rLa-NiVF可以诱导猪产生较高水平的中和抗体。本专利技术的成果目前国内外均无报道，具有很强的创新性。rLa-NiVF作为一种具有前瞻性，创新性，并且高效安全的防控尼帕病毒的候选疫苗，对我国应对尼帕病毒潜在威胁具有重要的战略意义。本专利技术提供制备表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤(1)构建重组转录质粒，该转录质粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因组cDNA序列，将所述重组转录质粒命名为pBRN_NiVF ；(2)构建转录辅助质粒系统，该辅助质粒系统包括编码所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的辅助质粒pBSNP、编码所述新城疫LaSota疫苗株的磷酸蛋白 (P)的cDNA序列的辅助质粒pBSP、和编码所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L) 的cDNA序列的辅助质粒pBSL ；(3)将步骤(1)的所述重组转录质粒PBRN-NiVF和步骤⑵的转录辅助质粒 pBSNP.pBSP.pBSL共转染所述新城疫LaSota疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；和(4)收获上清液，过滤后接种鸡胚尿囊腔拯救重组病毒株。更具体地，制备表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的方法描述如下以人工合成的尼帕病毒F基因cDNA (SEQ ID No. 1，其编码的F蛋白氨基酸序列为SEQ ID No. 2)为模板，利用PCR方法分别在F基因两端插入新城疫病毒特异性基因起始和终止序列以及Riie I限制性酶切位点，测序鉴定无误，将F基因插入到LaSota全长基因组质粒 (该质粒由本实验室构建，构建方法可参见已获得授权的专利申请号200510097997. 8， 专利技术名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，专利技术人步志高，陈化兰， 申请时间2005年9月2日)的P(磷蛋白)和M(基质蛋白)基因之间的Riie I位点，构建成全长重组质粒pBRN-NiVF，利用质粒提取试剂盒大量制备此重组质粒，同时以辅助质粒 pBSNP、pBSP、pBSL(所述辅助质粒的构建参见参考文献)共同转染BHK-21细胞(预先感染表达T7聚合酶的重组痘病毒)，72小时后以转染的细胞上清接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种72小时后取接种鸡胚的尿囊液做血凝试验HA和新城疫血凝抑制试验HI均呈阳性，初步表明病毒拯救成功。以拯救得到的重组病毒rLa-NiVF感染BHK-21细胞，并同时转4染表达尼帕病毒G蛋白的真核表达质粒PCAGG-NiVG，24小时后可以观察到尼帕病毒F和G 蛋白共同表达介导的特异性细胞融合；另用鼠抗MV F蛋白单克隆抗体作一抗用间接免疫荧光检测尼帕F蛋白在rLa-NiVF感染的BHK-21细胞中的表达，在荧光显微镜下可以观察到特异性的强烈的荧光信号。细胞融合试验与间接免疫荧光均证明重组病毒rLa-NiVF能够正确表达尼帕病毒F蛋白。本专利技术所用的新城疫LaSota疫苗株为AV1615(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC)，也由本实验室制备，制备方法参见已获得授权的专利申请号 200510097997. 8，专利技术名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，专利技术人步志高，陈化兰，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，温志远，葛金英，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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