一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法。本方法包括以下步骤：步骤1、利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微球，制得纳米酶使用液；步骤2、于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫酸终止反应。本发明专利技术先成功制备了纳米酶使用液，并将其用作TMB‑H2O2反应的催化剂，利用四环素的封闭作用控制纳米酶催化TMB‑H2O2的显色作用，根据四环素含量和显色作用强弱的关系建立起一种快速测定四环素族抗生素的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法。
技术介绍
酶是存在生命体中的一类具有催化活性的生物大分子，具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。然而，天然酶易变性失活、提纯困难、价格昂贵、储藏和使用不便、成本高，这些缺点促使研究工作者寻求具有天然酶催化功能的人工模拟酶物质来满足实际需要。纳米材料从尺寸、形状以及表面电荷来说，与天然酶具有一定的相似之处。2007年，Yan课题组首次发现磁性Fe3O4纳米粒子具有内在类似辣根过氧化物酶的催化活性，提出了氧化铁纳米颗粒模拟酶的概念。近年来，基于纳米材料的模拟酶(nanozymes，纳米酶)被誉为新一代的人工模拟酶。相对于天然酶，纳米酶对酸、碱、温度的稳定性好，而且反应活性较高及廉价易得等优点，已在免疫分析、癌症诊断、环境污染物降解、纳米载药、尤其是比色生物传感等多个领域引起了人们的广泛关注。基于纳米酶的比色生物传感的原理是将物质的检测转化为颜色的变化从而达到裸眼检测的目的，具有制备方法简单、成本低廉、实用性强等优点。Wang及Qu课题组分别详尽评述了有关纳米酶的最新研究进展。在综述中分类总结了可用于比色生物传感的纳米酶：金属氧化物纳米颗粒如CeO2、Fe3O4、Co3O4、CuO、MnO2、V2O5等；贵金属纳米材料如Au、Pt及复合金属纳米材料等；碳基纳米材料如富勒烯、石墨烯、碳纳米管及其它纳米材料等。从中我们可知，目前基于纳米酶的比色生物传感在生物医学分析和环境监测等分析化学研究领域已取得了巨大的成功。金属-有机骨架材料(metal-organicframeworks，MOF)是利用有机配体与金属离子间的络合作用自组装形成的多孔有机－无机杂化材料。MOF具有高度有序的孔结构、孔尺寸可控、超大比表面积、暴露的金属位点、规则的晶体形状等优点，可克服传统纳米酶的一些不足，是有望用作纳米酶的潜在理想纳米材料。四环素类药物(Tetracyclines)因其广谱、价格便宜等因素，在兽医临床中被广泛使用，此外，由于四环素类药物在促进禽畜生长，提高饲料利用率方面有很好的作用而被广泛用作饲料添加剂，尤其是一些养殖户滥用、超范围使用必然导致其在禽畜产品中过量残留从而影响禽畜产品的质量安全，在使用过程中大部分抗生素以原药和代谢产物的形式进入环境，并可能通过食物链对生态环境产生毒害作用。目前我国关于此类药物的检测主要采用液相色谱－质谱/质谱、高效液相色谱法、ROSA法以及放射受体分析法等，这些方法有的设备昂贵，有的操作步骤繁琐，难以在基层中推广。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，为四环素类抗生素分子分析提供一种灵敏度高、选择性好、经济简便的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，包括以下步骤：步骤1、利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微球，制得纳米酶使用液；步骤2、于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫酸终止反应。本专利技术的有益效果在于：本专利技术成功制备了纳米酶使用液，并将其用作TMB-H2O2反应的催化剂，利用四环素的封闭作用控制Fe3O4@纳米酶催化TMB-H2O2的显色作用，根据四环素含量和显色作用强弱的关系建立起一种快速测定四环素族抗生素的方法，数据显示：该方法线性关系及精密度良好。用于实际样品的检测，方法检出限为0.035-0.043μg，回收率在90.9％～95.6％。附图说明图1为本专利技术具体实施方式的Fe3O4的XRD图；图2为本专利技术具体实施方式的Fe3O4磁性微球的红外光谱图；图3为本专利技术具体实施方式的Fe3O4磁性微球的SEM图；图4为本专利技术具体实施方式的Fe3O4磁性微球的TEM图；图5为本专利技术具体实施方式的4种抗生素的显色反应速率图6为本专利技术具体实施方式的不同的显色液体积对显色的影响；图7为本专利技术具体实施方式的不同体积的H2O2对显色的影响；图8为本专利技术具体实施方式的不同梯度金霉素的显色扫描；图9为本专利技术具体实施方式的4种抗生素的反应曲线。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于:制备得到的纳米酶使用液用作TMB-H2O2反应的催化剂，利用四环素的封闭作用控制Fe3O4@纳米酶催化TMB-H2O2的显色作用，建立起一种快速测定四环素族抗生素的方法。一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，包括以下步骤：步骤1、制备纳米酶使用液；利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微球，制得纳米酶使用液；步骤2、纳米酶检测四环素类抗生素；于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫酸终止反应。从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：本专利技术成功制备了纳米酶使用液，并将其用作TMB-H2O2反应的催化剂，利用四环素的封闭作用控制Fe3O4@纳米酶催化TMB-H2O2的显色作用，根据四环素含量和显色作用强弱的关系建立起一种快速测定四环素族抗生素的方法，数据显示：该方法线性关系及精密度良好。用于实际样品的检测，方法检出限为0.035-0.043μg，回收率在90.9％～95.6％。进一步的，所述步骤1制备纳米酶使用液具体如下：利用水热法合成Fe3O4磁性微球，称取0.5gFe3O4磁性微球并加入100mL0.1mol/L乙酸缓冲液超声分散1min，得到5mg/mL的储备液，于4℃暗处保存，临用前用乙酸缓冲液稀释储备液至0.5mg/mL即得纳米酶使用液。进一步的，所述步骤1中水热法合成Fe3O4磁性微球的方法如下：称取0.6gFeCl3·6H2O加入20mL乙二醇溶解，加入1.5g乙酸钠，用力搅拌30min，200℃保温30h，通过外加磁铁分离沉淀物，得到的磁性微球用纯水和乙醇洗涤多次，真空干燥6h，即制得Fe3O4磁性微球。进一步的，所述步骤2纳米酶检测四环素类抗生素具体如下：移取100μL纳米酶使用液，加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入1mLTMB显色液，0.8mL100mmol/LH2O2，混匀后于47℃孵育1小时后加入0.5mL2mol/L硫酸终止反应。进一步的，所述乙酸缓冲液的pH为4。实施例11实验部分1.1仪器和试剂UV2700分光光度计，(岛津中国)，FEITecnaiG20型高分辨透射电镜(美国FEI公司)，S4800冷场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)，MPMS-XL-7超导干涉量子仪(美国QuantumDesign公司)，GENESIS能谱仪(美国EDAX公司)，D8Advance粉末X射线衍射仪(德国布鲁克)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。无水乙醇、醋酸钠(西陇化工股份有限公司)；三氯化铁、乙二醇、色谱级甲醇、乙腈、丙酮(上海国药集团化学试剂有限公司)；TMB显色液(宿迁袁氏生物有限公司)；实验用水由Milli-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微球，制得纳米酶使用液；步骤2、于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫酸终止反应。

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、利用水热法合成Fe3O4磁性微球，再用乙酸缓冲液超声分散Fe3O4磁性微球，制得纳米酶使用液；步骤2、于步骤1制得的纳米酶使用液中加入四环素类抗生素溶液，振荡摇匀，加入TMB显色液和H2O2，混匀后于40～47℃下孵育1～1.5小时，后加入硫酸终止反应。2.根据权利要求1所述的基于纳米酶检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，所述步骤1具体如下：利用水热法合成Fe3O4磁性微球，称取0.5gFe3O4磁性微球并加入100mL0.1mol/L乙酸缓冲液超声分散1min，得到5mg/mL的储备液，于4℃暗处保存，临用前用乙酸缓冲液稀释储备液至0.5mg/mL即得纳米酶使用液。3.根据权利要求1或2任一项所述的基于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈祥明，王丹红，李飞，林妍，杨燕萍，陈佳东，蔡佳铭，叶家星，蔡姗姗，石祥程，谢白璐，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建,35