一种牛乳中四环素类抗生素的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种牛乳中四环素类抗生素的检测方法，包括样品提取、样品净化和仪器分析步骤，样品提取步骤为：向待测牛乳样品中加入Na2EDTA-乙酸水溶液，混合后离心取上清液，即为样品提取液。本发明专利技术提供的牛乳中四环素类抗生素的检测方法，结果准确，操作简便快捷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种食品检验方法，特别涉及一种牛乳中兽药残留的检验方法。
技术介绍
四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素和强力霉素，由于其广谱抗菌效果，常被用在奶牛养殖过程中，用以防治奶牛消化系统感染及促进奶牛生长。但为了防止药物随食物链进入人体，对消费者健康产生威胁，欧盟以及我国农业部对四环素类抗生素在牛乳中的残留限量都作了严格规定。目前，用于检测四环素类抗生素的方法很多，大致可以分为微生物法、酶联免疫法、毛细管电泳法、电化学分析法、高效液相色谱法（HPLC）以及液相色谱-质谱联用法（LC-MS）。在HPLC法和LC-MS法中，样品前处理方法通常按照《GB/T21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法-液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》提供的前处理方法，采用Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液进行样品提取，该提取液配制步骤繁琐，导致在样品前处理步骤花费很多时间，不利于企业日常快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牛乳中四环素类抗生素的检测方法，结果准确，操作简便快捷。本专利技术公开的牛乳中四环素类抗生素的检测方法，包括样品提取、样品净化和仪器分析步骤，样品提取步骤为：向待测牛乳样品中加入Na2EDTA-乙酸水溶液，混合后离心取上清液，即为样品提取液。在牛乳中四环素类抗生素的检测方法的一种示意性实施方式中，样品提取步骤为：称取待测牛乳样品5g，加入 0.1mol/L Na2EDTA-乙酸水溶液20mL，混合后离心，取上清液，即为样品提取液。在牛乳中四环素类抗生素的检测方法的一种示意性实施方式中，样品提取步骤为：称取待测牛乳样品5g于50mL离心管中，加入 0.1mol/L Na2EDTA-乙酸水溶液20mL，在漩涡混合器上混合30s，然后在10000r/分钟下离心8分钟，取5mL上清液，即为样品提取液。在牛乳中四环素类抗生素的检测方法的一种示意性实施方式中，样品净化步骤为：取HLB固相萃取柱，用3至5mL甲醇和3至5mL 超纯水分别进行活化和平衡；再将样品提取液经过HLB固相萃取柱，固相萃取装置的流速不超过2mL/分钟；待样品提取液全部通过HLB固相萃取柱后，用3至5mL5%甲醇水溶液洗涤HLB固相萃取柱，弃去全部流出液；再用3至5mL甲醇洗脱HLB固相萃取柱，并搜集洗脱液至离心管中；然后将离心管中的洗脱液在40℃水浴下氮气吹干，再加入1.0mL定容液涡旋溶解，最后以0.22μm有机系滤膜过滤，即得到净化后样品；其中定容液的配制方法：取10mL乙腈，用水定容至100mL。在牛乳中四环素类抗生素的检测方法的一种示意性实施方式中，仪器分析步骤采用高效液相色谱-质谱联用法，色谱条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱，2.1×100mm，1.7μm；柱温为40℃；进样体积为10μL；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸-水；梯度洗脱：0～1.0 分钟，15%A；1.0～2.0 分钟，15%A～25%A；2.0～2.5 分钟，25%A～30%A；2.5～3.0 分钟，30%A；3.0～3.5 分钟，30%A～40%A；3.5～4.5 分钟，40%A～80%A；4.5～5.0 分钟，80%A～15%A，流速为0.4mL/分钟；质谱条件为：离子化模式为电喷雾正离子模式，质谱扫描方式为多反应监测，电离电压为3.00kV，离子源温度为120℃，去溶剂气温度为400℃，去溶剂气为N2，流量为500L/h，碰撞气为Ar，流量为50L/h。本专利技术提供的牛乳中四环素类抗生素的检测方法，结果准确，操作简便快捷；还可以节约试剂，从而降低了分析成本，更有利于环境保护。本专利技术的方法不仅适用于鲜牛乳的检测，也同样适用于复原乳或奶粉的检测。具体实施方式为了对专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明本专利技术的具体实施方式。实施例1。1、实验仪器超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）（TQD 美国Waters）；固相萃取装置（美国Supelco）。2、实验试剂与材料四环素、土霉素、金霉素、强力霉素标准品（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯；冰乙酸（优级纯）；实验室用水为去离子水；HLB固相萃取柱（60mg/3mL，美国waters公司）。3、溶液的配制3.1、标准溶液准确称取适量的四环素、土霉素、金霉素、强力霉素标准品，用甲醇配制成100mg/L的标准储备液，-18℃冰箱储存。使用时，根据需要用10%乙腈水溶液稀释成适当浓度的标准工作液；3.2、样品提取液0.1mol/L Na2EDTA-乙酸水溶液：在1000ml容量瓶中加入2ml冰乙酸，用超纯水定容至刻度，加入37.23g乙二胺四乙酸二钠，溶解并摇匀。配制步骤约需5分钟；0.2%乙酸水溶液：取2mL冰乙酸，用水定容至1L；淋洗液：取5mL甲醇，用水定容至100mL；定容液：取10mL乙腈，用水定容至100mL。4、色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1×100mm，1.7μm）；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸-水；梯度洗脱：0～1.0 分钟，15%A；1.0～2.0 分钟，15%A～25%A；2.0～2.5 分钟，25%A～30%A；2.5～3.0 分钟，30%A；3.0～3.5 分钟，30%A～40%A；3.5～4.5 分钟，40%A～80%A；4.5～5.0 分钟，80%A～15%A；流速：0.4mL/分钟。5、质谱条件离子化模式：电喷雾正离子模式（ES+）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；电离电压（kv）：3.00；离子源温度（℃）：120；去溶剂气温度（℃）：400；去溶剂气（N2）流量（L/h）：500；碰撞气（高纯Ar）流量（L/h）：50；锥孔电压、碰撞能量及定性和定量离子等质谱参数如表1 所示：表1 仪器分析的质谱参数设定化合物母离子（m/z）子离子1（m/z）碰撞能量1（eV）子离子2（m/z）碰撞能量2（eV）驻留时间（s）锥孔电压（V）土霉素461.2426.1*22443.2130.122四环素445409.7*22426.8170.122金霉素478.8443.6*27461.6230.122强力霉素445427.7*23153.6380.122注：*为定量离子。6、样品前处理6.1、样品的提取称取牛乳样品5g（精确到0.0001g）于50mL离心管中，加入 0.1mol/L Na2EDTA-乙酸水溶液20mL，在漩涡混合器上混合30s，然后在10000r/分钟下离心8分钟，取5mL上清液至另一离心管中，待净化；6.2、样品的净化取HLB固相萃取柱（50mg/3mL），分别用3mL甲醇和3mL 水活化和平衡，将上述待净化的上清液经过固相萃取柱，在固相萃取装置上控制流速在2mL/分钟之内，待样液全部通过固相萃取柱后，用3mL 5%甲醇水溶液淋洗液洗涤HLB固相萃取柱，弃去全部流出液，最后用3mL甲醇洗脱固相萃取柱，并搜集洗脱液至离心管中。然后将离心管中的洗脱液在40℃水浴下氮气吹干，加入1.0mL定容本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛乳中四环素类抗生素的检测方法，包括样品提取、样品净化和仪器分析步骤，其特征在于，所述的样品提取步骤为：向待测牛乳样品中加入Na2EDTA‑乙酸水溶液，混合后离心取上清液，即为样品提取液。

【技术特征摘要】
1.一种牛乳中四环素类抗生素的检测方法，包括样品提取、样品净化和仪器分析步骤，其特征在于，所述的样品提取步骤为：向待测牛乳样品中加入Na2EDTA-乙酸水溶液，混合后离心取上清液，即为样品提取液。2.根据权利要求1所述的牛乳中四环素类抗生素的检测方法，其中所述样品提取步骤为：称取待测牛乳样品5g，加入 0.1mol/L Na2EDTA-乙酸水溶液20mL，混合后离心，取上清液，即为样品提取液。3.根据权利要求1所述的牛乳中四环素类抗生素的检测方法，其中所述样品提取步骤为：称取待测牛乳样品5g于50mL离心管中，加入 0.1mol/L Na2EDTA-乙酸水溶液20mL，在漩涡混合器上混合30s，然后在10000r/分钟下离心8分钟，取5mL上清液，即为样品提取液。4.根据权利要求1至3中任意一项所述的牛乳中四环素类抗生素的检测方法，其中所述样品净化步骤为：取HLB固相萃取柱，用3至5mL甲醇和3至5mL 超纯水分别进行活化和平衡；再将所述样品提取液经过HLB固相萃取柱，固相萃取装置的流速不超过2mL/分钟；待所述样品提取液全部通过HLB固相萃取柱后，用3至5mL5%甲醇水溶液洗涤HLB固相萃取柱，弃去全部流出液；再用3至5mL甲醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔向云，张雪峰，李照，袁凤琴，徐向峰，常建军，宋晓东，
申请(专利权)人：内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15