四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法和应用，特点是对纳米纤维进行硅烷化处理并变性，再以强力霉素为模板分子、乙腈/甲醇为致孔剂、甲基丙烯酸为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，合成纳米纤维素分子印迹聚合物，用对合成聚合材料进行表征，填充于固相萃取小柱，并结合高效液相色谱法，根据标准曲线确定待测样品中四环素类抗生素的浓度，优点是具有灵敏度高、检测速度快、检测限低且高效、廉价。

【技术实现步骤摘要】
四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法和应用
本专利技术涉及食品安全检测领域，尤其是涉及一种用于检测食品中四环素类抗生素残留的纳米纤维分子印迹聚合物制备方法和应用。
技术介绍
四环素类抗生素(TetracyclineAntibiotic)为光谱型的抗菌药，常用于预防和治疗畜禽疾病过程，但由于药物的不合理使用，动物源食品中常存在四环素类药物的残留问题，危害人类健康。常用的四环四类抗生素主要有四环素(Tetracycline，TC)、金霉素(Chlortetracycline，CTC)、土霉素(Oxytetracycline，OTC)等，部分抗生素还可在动物体内经代谢而转化为差向四环素，不仅导致药效降低，而且其毒副作用增加。美国食品药品管理局规定上述三种四环素类抗生素最大残留量为2μg/g，中国农业部规定抗生素最大残留量为100ng/g。因此，食品中四环素类抗生素的检测迫在眉睫。微生物法是最常用的方法，但是该方法复杂、耗时、准确性不高。高效液相色谱结合其他方法的检测技术具有高灵敏度、高选择性和准确性，能满足对痕量四环素类抗生素的定性和定量分析，但操作复杂，前处理要求高，进样要求严格。因此，对样品进行富集、纯化，成为痕量分析过程中不可或缺的步骤。固相萃取技术因其设备简单、自动化程度高等优点，已广泛用于样品前处理。一般样品成分复杂，固相萃取过程特异性不高，而分子印迹固相萃取(Molecularlyimprintedsolid-phaseextraction,MISPE)是近几年快速发展起来的高选择性净化和富集新技术，将分子印迹聚合物填充于固相萃取小柱，对样品进行前处理，提高了检测特异性、准确性。纳米纤维素(NanocrystallineCellulose，NCC)，也称为纤维素纳米晶体，是一种直径在1-100nm，长度在几十到几百纳米的棒状纤维素，具有高纯度、高结晶度、高强度等优点。同时纤维素是天然高分子聚合物，NCC因聚集态结构和物性上的特殊性，使其在高性能聚合物中显示出巨大的应用前景。目前，国内外还没有公开任何关于四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法和应用的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有灵敏度高、检测速度快、检测限低且高效、廉价的四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法和应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法，以纳米纤维分子作为支撑载体，对其表面进行硅烷化，以强力霉素为模板分子、乙腈/甲醇为致孔剂、甲基丙烯酸(MAA)为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯(TRIM)为交联剂、偶氮二异丁腈(AIBN）为引发剂，合成四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物。具体包括如下步骤：（1）纳米纤维的制备取10gα-纤维素粉溶于100mL无水N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)中，超声20min后，160℃条件下活化2h，旋蒸3-4h（蒸出部分N,N-二甲基乙酰胺），加入1mmol无水氯化锂，转速200rpm，60℃下充分搅拌10h，然后再旋蒸3-4h除去部分N,N-二甲基乙酰胺得到的乳浊液，将乳浊液于8000～12000rmp转速下，离心15min，取下层凝胶体反复水洗至清洗液pH为6.5-7.5，然后在蒸馏水中透析过夜，最后在-40℃条件下，冷冻干燥24h，处理得到疏松的纤维素纳米；（2）硅烷化纳米纤维的制备取0.9g纳米纤维素分散于300mL乙醇/水混合液中，超声振荡15min，然后加入15mL氨水、2.1mL的正硅酸乙酯（TEOS）于反应体系中，40℃条件下，搅拌反应12h，用双蒸水和乙醇反复淋洗，8000～12000rmp转速下，离心15min，取下层凝胶体在-40℃条件下，冷冻干燥24h，得硅烷化纳米纤维粒子；其中乙醇/水混合液由乙醇与水按体积比4:1混合而成；（3）硅烷化纳米纤维的变性处理取0.25mg硅烷化纳米纤维粒子加入到30mL的含有3-巯丙基三甲氧基硅烷（MPTS）体积分数为1/6的甲苯溶液中，然后在氮气保护、120℃条件下，回流反应24h后，依次用甲苯和双蒸水洗涤3～5次，然后于8000～12000rmp转速下，离心15min，取下层凝胶体在-40℃条件下，冷冻干燥24h，得到变性的硅烷化纳米纤维材料；（4）沉淀聚合法合成纳米纤维分子印迹聚合物取圆底烧瓶，依次加入30mg步骤（3）中变性的硅烷化纳米纤维材料、3.0mmol强力霉素、60mL乙腈/甲醇混合液(35:30，V/V)、0.68mL经预处理的甲基丙烯酸(MAA)，超声15min后，加入10mmol经预处理的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯(TRIM)，超声10min；在氮气保护下，加入45mg经预处理的偶氮二异丁腈(AIBN)，于60℃磁力搅拌聚合24h，聚合反应结束后，减压抽滤，将滤饼用甲醇/乙酸混合液(7:1，V/V)洗涤3～5次，再用甲醇/乙酸混合液(7:1，V/V)索氏提取24h，抽提完成后，样品在-40℃条件下，冷冻干燥24h，得四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物。步骤（5）中所述的乙腈/甲醇混合液由乙腈与甲醇按体积比35:30混合而成，所述的甲醇/乙酸混合液由甲醇与乙酸按体积比7:1混合而成。步骤（5）中所述的甲基丙烯酸的预处理过程为将甲基丙烯酸减压蒸馏，收集69℃的馏分，-30℃冰箱保存备用；所述的三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯的预处理过程为用活性炭吸附除杂、过滤，收集滤液，-30℃冰箱保存备用；所述的偶氮二异丁腈的预处理过程为偶氮二异丁腈与甲醇按质量比1:10混匀后，50℃水浴，趁热抽滤，滤液静置30min，再次抽滤，收集结晶产物，密封，-40℃保存备用。所述的四环素类抗生素为四环素、金霉素和土霉素。一种纳米纤维分子印迹聚合物检测样品中四环素类抗生素浓度的方法，包括以下步骤：（1）样品处理将待测样品用组织捣碎机绞碎均匀，加入待测样品4倍体积的Mcllvaine缓冲溶液，超声浸提20min，离心15min取上清液，残留物再加入待测样品4倍体积的Mcllvaine缓冲溶液，超声浸提20min，离心15min取上清液，合并两次离心所得上清液，将上清液用0.45μm的微孔滤膜过滤得到待测样品液，冷藏备用；（2）分子印迹固相萃取小柱制备准确称取150mg纳米纤维分子印迹聚合物，用甲醇湿法装柱，填装好后，用真空泵将固相萃取小柱抽紧，即得分子印迹固相萃取小柱；（3）四环素类抗生素浓度测定将分子印迹固相萃取小柱用3mL甲醇溶液在流速为2mL/min的条件下，多次淋洗活化后，纯水清洗，再载入2mL待测样品液，吸附结束后，纯水清洗3-4次，再用甲醇溶液洗脱3～5次，收集洗脱液，将洗脱液用高效液相色谱测定，记录数据，根据四环素、金霉素和土霉素3种四环素类抗生素液相色谱峰面积与相应四环素类抗生素浓度的定量关系，确定待测样品中四环素、金霉素和土霉素3种四环素类抗生素的浓度。所述的Mcllvaine缓冲溶液的配制方法如下：7.10g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O、12.9g十二水柠檬酸(C6H8O7·12H2O)、3.72g乙二胺四乙酸二钠，用水溶解后稀释并定容至1000mL。高效液相色谱条件：色谱柱：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：以纳米纤维分子作为支撑载体，对其表面进行硅烷化，以强力霉素为模板分子、乙腈/甲醇为致孔剂、甲基丙烯酸为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，合成四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物。

【技术特征摘要】
1.一种四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：以纳米纤维素分子作为支撑载体，对其表面进行硅烷化，以强力霉素为模板分子、乙腈/甲醇为致孔剂、甲基丙烯酸为功能单体、三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，合成四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物。2.根据权利要求1所述的四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：(1)纳米纤维的制备取10gα-纤维素粉溶于100mL无水N,N-二甲基乙酰胺中，超声20min后，160℃条件下活化2h，旋蒸3-4h后，加入1mmol无水氯化锂，转速200rpm，60℃下充分搅拌10h，然后再旋蒸3-4h得到乳浊液，将乳浊液于8000～12000rpm转速下，离心15min，取下层凝胶体反复水洗至清洗液pH为6.5-7.5，然后在蒸馏水中透析过夜，最后在-40℃条件下，冷冻干燥24h，处理得到疏松的纳米纤维素；(2)硅烷化纳米纤维的制备取0.9g纳米纤维素分散于300mL乙醇/水混合液中，超声振荡15min，然后加入15mL氨水、2.1mL的正硅酸乙酯于反应体系中，40℃条件下，搅拌反应12h，用双蒸水和乙醇反复淋洗，8000～12000rpm转速下，离心15min，取下层凝胶体在-40℃条件下，冷冻干燥24h，得硅烷化纳米纤维粒子；其中乙醇/水混合液由乙醇与水按体积比4:1混合而成；(3)硅烷化纳米纤维的变性处理取0.25mg硅烷化纳米纤维粒子加入到30mL的含有3-巯丙基三甲氧基硅烷体积分数为1/6的甲苯溶液中，然后在氮气保护、120℃条件下，回流反应24h后，依次用甲苯和双蒸水洗涤3～5次，然后于8000～12000rpm转速下，离心15min，取下层凝胶体在-40℃条件下，冷冻干燥24h，得到变性的硅烷化纳米纤维材料；(4)沉淀聚合法合成纳米纤维分子印迹聚合物取圆底烧瓶依次加入30mg变性的硅烷化纳米纤维材料、3.0mmol强力霉素、60mL乙腈/甲醇混合液、0.68mL经预处理的甲基丙烯酸，超声15min后，加入10mmol经预处理的三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，超声10min；在氮气保护下，加入45mg经预处理的偶氮二异丁腈，于60℃磁力搅拌聚合24h，聚合反应结束后，减压抽滤，将滤饼用甲醇/乙酸混合液洗涤3～5次，再用甲醇/乙酸混合液索氏提取24h，抽提完成后，样品在-40℃条件下，冷冻干燥24h，得四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物。3.根据权利要求2所述的四环素类抗生素的纳米纤维分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的乙腈/甲醇混合液由乙腈与甲醇按体积比35:30混合而成...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘道东，王雅群，吴振，孙杨赢，曾小群，曹锦轩，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33