用于检测rs12041331的引物探针组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测rs12041331的引物探针组及其应用。本发明专利技术首先保护一种引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为序列表的序列3所示。本发明专利技术可用于检测rs12041331，判断待测样本基于该位点的基因型，从而指导用药，具有重大的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测rs12041331的引物探针组及其应用
本专利技术涉及一种用于检测rs12041331的引物探针组及其应用。
技术介绍
PEAR1基因是近年发现的调控血小板功能的重要基因，在血小板和内皮细胞中高度表达，它的磷酸化作用可促进血小板的聚集。人的PEAR1基因定位于1q23.1，约30kbp，包括23个外显子和22个内含子；其编码的蛋白是一种具有多表皮生长因子类似物区域的横跨膜1型蛋白，该蛋白是细胞外蛋白质相互作用区域的组成部分，胞外部分有15个表皮生长因子样重复单元，具有多个酪氨酸和脯氨酸，胞内的区域结构包括5个脯氨酸区域和一个NPXY922区域，均为磷酸化酪氨酸的结合点。rs12041331是位于PEAR1基因中的一个SNP，存在两种多态形式，G/A，G为野生型，A为突变型，人群中存在三种基因型，分别为GG,GA,AA，其多态性与PEAR1蛋白表达量显著相关。氯吡格雷和阿司匹林是临床上常用的抗血小板聚集药物，二者联合应用是经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneouscoronaryintervention，简称PCI）术后患者抗血小板聚集治疗最常用的给药方案。然而，部分PCI术后患者按照常规剂量服用氯吡格雷联合阿司匹林抗血小板治疗效果不佳，其原因可能与患者自身肝脏中的药物代谢酶基因多态性有关。研究发现，PEAR1基因多态性与阿司匹林疗效最相关，突变携带者则心血管不良事件发生的概率显著增加。PEAR1基因可调控PI3K/PTEN（phosphatidylinositol3kinase，磷脂酰肌醇3激酶，pentaerythritoltetranitrate四硝酸戊赤藓醇）通路，影响血小板的功能。PEAR1基因具有激活血小板、降低巨核祖细胞（血小板祖细胞）的增殖、影响血小板的聚集反应等功能，与冠心病和粘血症等疾病相关联。因此，PEAR1基因多态性将会导致阿司匹林抗血小板治疗效果出现显著的个体化差异。GG等位基因对阿司匹林抗血小板效果应答较好；GA/AA基因型，用阿司匹林（或结合氯吡格雷），PCI患者，心梗和死亡率较高。PEAR1AA和AG基因型者，标准治疗，心梗和死亡风险是GG基因型的2.03~3.97倍。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测rs12041331的引物探针组及其应用。本专利技术首先保护一种引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。探针P为5’末端具有FAM荧光基团且3’末端具有BHQ1荧光淬灭基团的单链DNA分子。具体来说，所述探针P的核苷酸序列如序列表的序列3所示，且第2-4位核苷酸和第23-25位核苷酸均为锁核酸。所述引物探针组中，引物F、引物R、探针P的摩尔配比为：15：5：10。本专利技术还保护所述引物探针组在制备用于检测rs12041331的试剂盒中的应用。本专利技术还保护一种用于检测rs12041331的试剂盒，包括所述引物探针组。本专利技术还保护组件甲和组件乙在制备用于检测rs12041331的试剂盒中的应用；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种用于检测rs12041331的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种试剂盒，包括裂解液。所述试剂盒的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。所述试剂盒还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，包括如下步骤：（1）取抗凝血，加入所述裂解液，颠倒混匀，离心弃上清；（2）完成步骤（1）后，加入所述保存液，先60-70℃（具体可为65℃）水浴，再80-90℃（具体可为85℃）水浴，然后离心，使用时取上清，即为模板样本。所述用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，具体包括如下步骤：（1）取65μLEDTA抗凝血，加入500μL所述裂解液，颠倒混匀，12000rpm离心4min，弃上清；（2）完成步骤（1）后，加入120μL所述保存液，先65℃水浴10min，再85℃水浴10min，然后12000rpm离心4min，然后置于4℃保存备用，使用时取上清，即为模板样本。本专利技术还保护特异探针在进行荧光定量PCR检测中的应用；所述特异探针为具有锁核酸修饰的分子信标。本专利技术还保护一种用于荧光定量PCR检测的特异探针，为具有锁核酸修饰的分子信标。以上任一所述rs12041331为人基因组DNA中序列表的序列4所示核苷酸的第73位核苷酸。以上任一所述rs12041331为人基因组中的PEAR1基因中序列表的序列4所示核苷酸的第73位核苷酸。本专利技术旨在检测PEAR1基因中最主要的单核苷酸多态性位点的基因分型，判定患者的药物代谢速率类型，从而帮助医生正确选择药物并合理调整药物剂量，提高药物使用有效性，并降低毒副作用。本专利技术提供的引物探针组，采用分子信标作为探针，并且引入了若干锁核酸。分子信标是一种荧光探针，由环状区和茎干区组成，其茎干区的5'末端标记荧光基团，3'末端标记猝灭基团，闭合时呈发夹结构，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，整体不发出荧光信号。当目标序列存在时，环部与目标序列结合，茎干部分被迫打开，荧光基团远离淬灭基团，发出荧光。具有单核苷酸差异的核苷酸链之间ΔTm值很小，一般检测手段难以区分。锁核酸是一类双环状寡核苷酸衍生物，能够遵循碱基互补配对原则与核酸结合，其结构中的β-D-呋喃核糖的2'-O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

【技术特征摘要】
1.引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述探针P的核苷酸序列如序列表的序列3所示，且第2-4位核苷酸和第23-25位核苷酸均为锁核酸。3.权利要求1或2所述引物探针组在制备用于检测rs12041331的试剂盒中的应用。4.一种用于检测rs12041331的试剂盒，包括权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛茜，刘婷婷，李朋，赵海文，吴守峰，李欣，邱茂仁，穆磊，
申请(专利权)人：潍坊德诺泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37