本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种KIR2DL2 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒，引物和探针的设计方法包括以下步骤：（1）运用PCR‑SSOP方法对DNA样本进行KIR基因分型，筛选出KIR2DL2阳性DNA；（2）将阳性DNA样本进行PCR扩增、电泳；（3）提取KIR2DL2特异性DNA条带，经割胶、纯化后与T载体连接，经转化、挑选菌群后抽取质粒测序；（4）测序结果与KIR/IPD数据库进行比对，证实其为特征性基因序列；（5）根据特征性KIR2DL2基因序列，运用引物设计软件，设计出引物和探针。使用设计出的引物和探针进行基因检测。该方法提高了PCR检测的特异性和准确率。
【技术实现步骤摘要】
一种KIR2DL2mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种KIR2DL2mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）是主要表达于NK细胞膜表面的一种跨膜糖蛋白，其与配体HLA分子相互作用，产生同种异源NK细胞，发挥GVL效应，在造血干细胞移植的预后方面产生重要作用。KIR位于人染色体19q13.4，含有2个（KIR2D）或3个（KIR3D）胞外Ig样结构域，分为抑制性KIR（inhibitoryKIR,iKIR）及激活性KIR（activatingKIR,aKIR）两类，iKIR基因包括有异源反应活性功能的KIR2DL1、KIR2DL2、KIR3DL1等，aKIR基因包括KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DL2、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1等。KIR各基因之间DNA序列80-90%相同，目前对于引物设计，多在NCBI上寻找目的基因序列，或者对该基因进行全基因测序，进而根据基因序列通过引物设计软件，设计出引物后，进行blast；这些方法在设计KIR各基因引物时均存在一定的局限性，主要表现为效率低、特异性差、准确率低。
技术实现思路
为了解决以上现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种KIR2DL2mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒，以提高KIR2DL2的检测效率以及检测的特异性。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：荧光定量PCR检测KIR2DL2mRNA的引物和探针，其序列为：2DL2F：5’-AGAAACCTTCTCTCTCAGCCC-3’；2DL2R：5’-GCCCTGCAGAGAACCTACA-3’；荧光探针：5’-TCCTGCAGCTCCCGG-3’。获取权利要求1所述的引物和探针的方法，包括以下步骤：（1）抽提正常人DNA样本，运用PCR-SSOP方法进行KIR基因分型，筛选出KIR2DL2阳性的正常人DNA样本；（2）将筛选出的DNA样本采用市售KIR2DL2序列特异性引物扩增板（购于OneLambda）进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳；（3）提取KIR2DL2特异性条带中的PCR产物，经割胶、纯化后，与T载体进行连接，转化受体是TOP10感受态耐链霉素的大肠杆菌，挑选菌群后，抽取质粒，使用ABI3730XL型测序仪进行测序；（4）测序结果与KIR/IPD数据库进行比对，证实其为特征性KIR2DL2基因序列，测序获得的具体序列为：5’-AGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAGGGGGAGGCCCATGAATGTAGGTTCTCTGCAGGGC-3’；（5）根据特征性KIR2DL2基因序列，运用引物设计软件，设计出如权利要求1所述的引物和探针。进一步的，获取本专利技术所述的引物和探针的方法中，PCR扩增采用的仪器为PerkinElmerGeneAmp9700PCR扩增仪。进一步的，获取本专利技术所述的引物和探针的方法中，所述步骤（3）中使用的T载体为pMD18-TVector。进一步的，获取本专利技术所述的引物和探针的方法中，所述的引物和探针通过primerexpress软件进行设计。本专利技术所述的荧光定量PCR检测KIR2DL2mRNA的引物和探针在制备KIR2DL2mRNA荧光定量PCR检测试剂盒中的用途。检测KIR2DL2mRNA的方法包括以下步骤：（1）提取总RNA；（2）将RNA逆转录为cDNA；（3）使用权利要求1中的引物和探针，运用荧光定量PCR通用体系，检测KIR2DL2的mRNA转录水平。有益效果：本专利技术提供了一种KIR2DL2mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒，本专利技术通过采用PCR-SSOP方法对正常人DNA样本进行常规KIR基因分型，筛选出KIR2DL2阳性样本后，将其DNA样本采用特异性引物进行PCR扩增、电泳，将PCR产物与T载体连接，并进行克隆性扩增、筛选、测序，由于PCR产物不专一，直接测序效果不好，PCR产物直接测序，引物端约有几十个碱基是测不出来的，如果恰好需要这段序列，直接测序将错过此段基因序列。使用PCR产物与T噬菌体连接，可避免上述问题。而且该专利技术最终直接找出KIR2DL2基因序列中的特征性基因序列，直接避免了扩增出其他同源性高的其他未知条带。使用本专利技术获得的引物和探针进行KIR2DL2mRNA的荧光定量PCR检测，具有特异性强、准确率高的特点，同时本专利技术设计引物和探针的方法亦可运用予其他同源性高的KIR基因。附图说明图1为本专利技术实施例中ABL标准品的荧光定量PCR标准曲线图，以表1的数据作为横纵坐标得出标准曲线，横坐标是以ABL标准品拷贝数的对数值表示，具体为log10（200，2000，20000，200000，200000）=（2.3010，3.3010，4.3010，5.3010，6.3010），纵坐标即是ABL标准品的Ct值。图2为本专利技术进行KIR2DL2mRNA荧光定量PCR检测的设计思路图。图3为用本专利技术设计的KIR2DL2引物探针进行荧光定量PCR检测得到的KIR2DL2阳性产物的1.5%琼脂糖电泳图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实验方法：1.DNA抽提：根据DNA抽提试剂盒（购自美国Promega公司）说明书全血提取DNA2.PCR-SSOP进行基因分型：该步实验使用KIRSSO基因分型试剂盒（购于OneLambda公司）进行操作。2.1PCR反应体系：KIRSSO扩增分Group1、Group2、Group3三组，每个反应孔加D-Mix7.5µL，Primer2µL，Taq酶0.1µL，DNA样本2.5µL，（D-Mix、Primer购于OneLambda公司）。2.2经PerkinElmerGeneAmp9700PCR扩增仪进行PCR扩增，PCR扩增条件：96℃3min1个循环；96℃20s，60℃20s，72℃20s共5个循环；96℃10s，60℃，15s，72℃20s，共32个循环；72℃10min1个循环；4℃终止。2.3将扩增产物使用碱性液变性后，再使用酸性液中和，之后再加微珠和荧光二抗进行孵育，洗涤后，使用Luminex200仪器上机检测，筛选出KIR2DL2阳性的正常人DNA样本。3.PCR扩增3.1PCR反应体系：PCR缓冲液115µL，ddH2O152µL，步骤2筛选出的KIR2DL2阳性的DNA样本31µL，Taq酶1.8µL，KIR2DL2序列特异性引物扩增板（PCR缓冲液、KIR2DL2序列特异性引物扩增板购于OneLambda公司）；3.23000rpm离心15-20s；3.3经PerkinElmerGeneAmp9700PCR扩增仪进行PCR扩增，PCR扩增条件：预本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.荧光定量PCR检测KIR2DL2 mRNA的引物和探针，其特征在于，其序列为：2DL2F：5’‑ AGAAACCTTCTCTCTCAGCCC ‑3’；2DL2R：5’‑ GCCCTGCAGAGAACCTACA ‑3’；荧光探针：5’‑ TCCTGCAGCTCCCGG ‑3’。
【技术特征摘要】
1.荧光定量PCR检测KIR2DL2mRNA的引物和探针，其特征在于，其序列为：2DL2F：5’-AGAAACCTTCTCTCTCAGCCC-3’；2DL2R：5’-GCCCTGCAGAGAACCTACA-3’；荧光探针：5’-TCCTGCAGCTCCCGG-3’。2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测KIR2DL2mRNA的引物和探针，其特征在于，获取所述的引物和探针的方法，包括以下步骤：（1）抽提正常人DNA样本，运用PCR-SSOP方法进行KIR基因分型，筛选出KIR2DL2阳性的正常人DNA样本；（2）将筛选出的DNA样本采用市售KIR2DL2序列特异性引物扩增板进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳；（3）提取KIR2DL2特异性条带中的PCR产物，经割胶、纯化后，与T载体进行连接，转化受体是TOP10感受态耐链霉素的大肠杆菌，挑选菌群后，抽取质粒，使用ABI3730XL型测序仪进行测序；（4）测序结果与KIR/IPD数据库进行比对，证实其为特征性KIR2DL2基因序列，测序获得的具体序列为：5’-AGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGTGACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：何军，李颖，邱桥成，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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