厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶--一种新型的海洋污染检测标记物制造技术

本发明专利技术公开了厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，其为克隆基因，通过基因克隆技术获得。本发明专利技术还公开一种新型海洋生物污染检测标记物，用厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因用作海洋污染的检测标记物。本发明专利技术通过基因克隆技术获得的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，其在厚壳贻贝的消化腺中的相对表达量最高，克隆用引物合适、能增大PCR反应的成功性，克隆用裂解液能够保持所得总RNA的完整性、提高总RNA的得率和纯度；本发明专利技术利用厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶--一种新型的海洋污染检测标记物
本专利技术涉及分子生物
，尤其是涉及厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶--一种新型的海洋污染检测标记物。技术背景我国东海地区海域带处于海洋与陆地的过渡地带，陆地工农业生产、海洋产业开发等排放的废水多在此汇集。其中重金属、石油类(BAP)等污染物易通过吸附等作用结合到悬浮颗粒物或胶体表面而被沉淀富集，会对底栖生物产生较大的影响。有研究表明，生物组织中标志物活性（含量）与环境中污染物含量呈一定相关性，因此，研究东海海域沉积物中污染物的含量变化，能够为筛选生物标志物提供基础数据，同时有利于初步掌握不同区域的污染特征和来源，对于应用生物标志物法评价周围人类活动对海域环境的生态压力有重要作用。厚壳贻贝（Mytiluscoruscus）俗称“海红”，隶属软体动物门、双壳纲、贻贝目，是一种栖息于海水中的常见双壳经济贝类，北至辽宁大连，南至福建东山均有分布，以浙江沿海资源量最大，其软体部蛋白质含量较高，鲜味氨基酸和必需氨基酸组成丰富，微量元素构成合理，属营养价值和经济价值都较高的海产贝类。但随着近年来沿海城市工业化进程的加速，厚壳贻贝繁殖的周边海域水质、环境因子持续恶化，生境污染不断加剧，作为一种典型的滤食性潮间带生物，厚壳贻贝因具有个体较大，生活史较长，活动性差，容易采集，对环境污染物（如重金属、病原微生物等）具有很强的耐受性等特征，常被作为环境指示生物来监测海区环境的变化。厚壳贻贝在解毒过程中会大量产生氧自由基，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）具有清除脂质过氧化物、过氧化氢，减轻有机氢过氧化物的功能，可以减少机体解毒过程中产生的活性氧自由基，防止细胞膜等生物组织受到氧化损伤。其在受到刺激后会做出相应的反应，应对环境对其产生的毒理效应。因此，可以选择厚壳贻贝的谷胱甘肽过氧化物酶作为检测海洋环境污染的指示分子。生物体在分子水平上的改变可以反应污染物对生物的早期作用，因而可作为灵敏的指标，用于检测污染对海洋生物个体、种群、生态系统的影响，从而达到预测海洋污染和保护海洋生物及生态系统的目的。同时，也可以应用到水产养殖业，用于检测水质的变化。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种通过基因克隆技术获得的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，其在厚壳贻贝的消化腺中的相对表达量最高，克隆用引物合适、能增大PCR反应的成功性，克隆用裂解液能够保持所得总RNA的完整性、提高总RNA的得率和纯度。本专利技术的目的之而在于提供一种利用厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，谷胱甘肽过氧化物酶基因为克隆基因，通过基因克隆技术获得。本专利技术通过基因克隆技术首次克隆出厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶的基因核心片段、全长及特异性引物；筛选出厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在不同组织表达量的高低，其中消化腺相对表达量最高。优选的，克隆方法的包括总RNA提取、cDNA第一链的合成、过氧化物酶基因核心片段PCR扩增、过氧化物酶基因RACE扩增全长、筛选、生物信息学分析，其特征在于：所述过氧化物酶基因核心片段PCR扩用引物为：GPx-REAL-F1:5’-GTTAGAGGCCGAGCTGAAGC-3’；GPx-REAL-R1:5’-GTTGTAACTTTTCAGGTAGT-3’。本专利技术谷胱甘肽过氧化物酶基因核心片段PCR扩用引物的长度、上下游引物长度的差对PCR反应的扩增较为合适，且上下游引物的Tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性。进一步优选，克隆方法具体包括如下步骤：1）总RNA提取：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA；2）cDNA第一链的合成：以步骤1获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；3）基因核心片段PCR扩增：根据NCBI数据库中谷胱甘肽过氧化物酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而PCR扩增出谷胱甘肽过氧化物酶的基因核心序列，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收，备用；4）RACE扩增全长：基于步骤3获得的基因序列，根据所得的目的序列进行了RACE引物的设计，利用RACE技术扩增得到5’端和3’端序列以及ORF区的验证序列；5）筛选：将步骤4获得的RACE反应产物连接至PMD18-T载体并转至DH5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后进行序列测定，获得谷胱甘肽过氧化物酶基因序列，由于前面测序得到的目的序列不完整以及目的PCR片段浓度较低达不到测序要求，因此需要对PCR片段进行克隆扩增；6）生物信息学分析：将步骤5获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。该克隆方法能够有效得到谷胱甘肽过氧化物酶的基因序列和其编码蛋白质的氨基酸序列，同时能发现在厚壳贻贝的消化腺中谷胱甘肽过氧化物酶基因的相对表达量最高，而基因在消化腺中过量表达可以提高厚壳贻贝中p-糖蛋的表达量，从而可以提高厚壳贻贝对抗生存的水体环境中污染的能力，提高繁殖与生存能力，且可以用于检测海洋污染。更进一步优选，总RNA提取用混合裂解液，其中500ul混合裂解液含有490ulTrizol、5ul4-喹啉醇和5ulDL-泛醇。4-喹啉醇和DL-泛醇的特殊存在，在苯酚裂解细胞后，能够迅速和Trizol液体中的苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等物质发生增益作用，使细胞释放出的蛋白质迅速发生变性并抑制细胞释放出的RNA酶活性，能够保持所得总RNA的完整性，同时将促使核蛋白复合体的解离，使得总RNA和蛋白质完全分离，并将总RNA释放到溶液中，提高总RNA的得率和纯度，即使组织起始量太少或者太多，也能保证Trizol液体的裂解能力，得到目标总RNA。更进一步优选，PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O15.5μl、10×PCRbuffer2.5μl、20mMMgCl22.5μl、2.5mMdNTP1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μMSp-sCAP-F1.0μl、cDNA1.0μl、rTaq酶0.5μl。更进一步优选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物。本专利技术还提供一种利用上述厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶用作新型海洋生物污染检测标记物，用厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因用作海洋污染的检测标记物。本专利技术利用厚壳贻贝贝谷胱甘肽过氧化物酶基因用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因贝谷胱甘肽过氧化物酶基因具有灵敏性、易于检测分析，也可以用于厚壳贻贝的人本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征在于：所述谷胱甘肽过氧化物酶基因为克隆基因，通过基因克隆技术获得。

【技术特征摘要】
1.厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征在于：所述谷胱甘肽过氧化物酶基因为克隆基因，通过基因克隆技术获得。2.权利要求1所述的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，其克隆方法的包括总RNA提取、cDNA第一链的合成、过氧化物酶基因核心片段PCR扩增、过氧化物酶基因RACE扩增全长、筛选、生物信息学分析，其特征在于：所述过氧化物酶基因核心片段PCR扩用引物为：GPx-REAL-F1:5’-GTTAGAGGCCGAGCTGAAGC-3’；GPx-REAL-R1:5’-GTTGTAACTTTTCAGGTAGT-3’。3.根据权利要求2所述的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征在于：所述克隆方法具体包括如下步骤：1）总RNA提取：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA；2）cDNA第一链的合成：以步骤1获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；3）基因核心片段PCR扩增：根据NCBI数据库中谷胱甘肽过氧化物酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而PCR扩增出谷胱甘肽过氧化物酶的基因核心序列，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收，备用；4）RACE扩增全长：基于步骤3获得的基因序列，根据所得的目的序列进行了RACE引物的设计，利用RACE技术扩增得到5’端和3’端序列以及ORF区的验证序列；5）筛选：将步骤4获得的RACE反应产物连接至PMD18-T载体并转至DH5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后进行序列测定，获得谷胱甘肽过氧化物酶基因序列；6）生物信息学分析：将步骤5获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。4.根据权利要求3所述的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆方法，其特征在于：所述总RNA提取用混合裂解液，所述500ul混合裂解液含有490ulTrizol、5ul4-喹啉醇和5ulDL-泛醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭宝英，叶莹莹，刘硕博，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33