聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体、制备方法及抗氧化应用技术

一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体、制备方法及重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体用聚乙二醇修饰前后在抗氧化方面的应用，属于生物技术领域。是采用活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯作为修饰剂，与重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体在4～37℃、pH＝6.0～9.0条件下反应10～60min，加入终止剂甘氨酸终止反应，透析去除副产物，得到突变体；其中，重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体与活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯的用量质量比为1：10～120。经测定其氨基修饰率最高可达98.73％，当氨基修饰率达40％以上时，进入体内后就可完全消除异体蛋白的抗原抗体反应，因此本发明专利技术产物具有消除酶蛋白抗原抗体反应的特性。

【技术实现步骤摘要】
聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体、制备方法及抗氧化应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体、制备方法及重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体用聚乙二醇修饰前后在抗氧化方面的应用。
技术介绍
谷胱甘肽是含硒的谷胱甘肽过氧化物酶GPx1的底物，硒代半胱氨酸SeCys是其催化基团。GPx同超氧化物歧化酶SOD、H2O2酶CAT是生物机体组织中存在的三种重要的抗氧化酶。GPx1是含硒GPx重要的亚型之一，在抗氧化体系中发挥重要作用，可以清除体内H2O2及各类氢过氧化物，阻断活性氧ROS，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的衰老、白内障、肿瘤及心脑血管等疾病。GPx1不仅能清除ROS，还可以谷胱甘肽GSH为还原剂降解脂质过氧化物，使细胞膜和其他机体生物组织免受过氧化作用的损伤，这种独特的保护作用使其在抗氧化酶体系中具有重要作用，是一种具有广泛市场应用前景的医药用酶。但该酶在常温条件下其巯基易氧化导致酶活力降低、半衰期短及稳定性相对较低，从而限制了其应用。对该酶进行化学修饰，在保持其酶活力同时以提高其生物学稳定性。中国专利201110122788.X公开了一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法，该制备方法提供了一种修饰性猪谷胱甘肽过氧化物酶的方法，不包括重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体及其GPx1模拟酶的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化修饰方法。该制备方法是将单链单甲氧基聚乙二醇通过游离氯原子与谷胱甘肽过氧化物酶的氨基发生反应，且氨基修饰率为40～45％，在pH＝10.0条件下，1.5天酶活力为68.79％。本专利的制备方法，采用单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯与谷胱甘肽过氧化物酶的氨基发生反应，且氨基修饰率为98.73％，在pH＝10.0条件下，15天后酶活力为77.93％，显著高于已公开专利201110122788.X。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种稳定性强的聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体(mPEG-GPx1)。本专利技术的第二个目的是提供上述聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体(mPEG-GPx1)的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供上述重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体用聚乙二醇修饰前后在抗氧化方面的应用。mPEG修饰后GPx1的抗氧化作用强于修饰前，具体见本
技术实现思路
有益效果的(6)、(7)、(8)和实施例(5)～(10)，也见图10～图15。本专利技术公开的单甲氧基聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体，由重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体的氨基与活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯连接，其结构式如下所示：其中GPx1表示重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体，该重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体是经基因重组表达制得(参见中国专利201310302778.3)，mPEG表示单甲氧基聚乙二醇。本专利技术的另一个目的是提供上述单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体(mPEG-GPx1)的制备方法，是采用活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯作为修饰剂，与重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体反应，反应式为：其中GPx1表示重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体。具体步骤为：采用活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯作为修饰剂，与重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体在4～37℃、pH＝6.0～9.0条件下反应10～60min，加入终止剂甘氨酸终止反应，透析去除副产物，得到单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体；其中，重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体与活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯的用量质量比为1：10～120；优选的：重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体与活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯的用量质量比为1：60；反应条件为20℃、pH＝8.5条件下反应30min。其中活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯，通过以下步骤制备得到：(1)称取分子量2000～12000的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)1.0～3.0g，加入2～6mLN，N-二甲基甲酰胺，充分溶解；(2)向步骤(1)溶液中加入0.06～0.18g丁二酸酐，混匀，密封；(3)将步骤(2)混合物于90～100℃条件下反应2～4小时；(4)将步骤(3)反应液冷却至室温，加入0.233～0.699gN-羟基琥珀酰亚胺、0.413～1.238g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加热使其溶解；(5)将步骤(4)混合物于25～30℃条件下反应8～12小时，冷却至室温；(6)将步骤(5)冷却后反应液于0～8℃条件下，逐滴加入20～60mL乙醚，将所得沉淀过滤，真空干燥，再将干燥产物以二氯甲烷溶解，然后再用乙醚沉淀；重复将所得沉淀过滤、真空干燥、干燥产物以二氯甲烷溶解、再用乙醚沉淀操作过程3～5次；(7)将步骤(6)所得产物真空干燥，即得到活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯。本专利技术采用重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体为实施对象，与现有技术相比具有以下有益效果：(1)本专利技术首次采用活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯连接到重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体上，经测定其氨基修饰率最高可达98.73％；当氨基修饰率达40％以上时，进入体内后就可完全消除异体蛋白的抗原抗体反应，因此本专利技术的单甲氧基聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体具有消除酶蛋白抗原抗体反应的特性；(2)本专利技术所获得的单甲氧基聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体，在pH＝9.0条件下酶活力保持率高达100％，即与基因重组酶活力相近；(3)酶的pH稳定性提高：在pH5.0及pH11.0条件下，重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体保持相对酶活为25.28％和48.62％；而单甲氧基聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体保持相对酶活为26.09％和53.36％，表明在低pH5.0及高pH11.0条件下其稳定性更好；(4)酶的热稳定性提高：在55℃时，重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体保持相对酶活为51.44％；而单甲氧基聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体保持相对酶活为59.04％，表明其热稳定性好；(5)酶的长期稳定性提高：在4℃条件下存放120天，单甲氧基聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体相对比活力可以保持63.69％，而GPx1突变体活力维持47.77％；在-20℃条件下存放90天，单甲氧基聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体相对比活力可以保持77.39％，而GPx1突变体活力维持60.42％；在冻干条件下存放12个月，单甲氧基聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体相对比活力可以保持91.22％，而GPx1突变体活力维持89.50％。说明经过mPEG修饰后的GPx1可以提高酶活稳定性。(6)GPx1和mPEG-GPx1都有抗氧化应激损伤能力，但后者强于前者：在30μmol/L阿霉素诱导的人胚肾HEK293T细胞氧化应激模型中，模型组细胞存本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体，其结构式如下所示：

【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体，其结构式如下所示：其中GPx1表示重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体，mPEG表示单甲氧基聚乙二醇。2.权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体的制备方法，其特征在于：采用活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯作为修饰剂，与重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体在4～37℃、pH＝6.0～9.0条件下反应10～60min，加入终止剂甘氨酸终止反应，透析去除副产物，得到聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体；其中，重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体与活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯的用量质量比为1：10～120。3.如权利要求2所述的一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体的制备方法，其特征在于：重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体与活化的直链状单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯的用量质量比为1：60；反应条件为20℃、pH＝8.5条件下反应30min。4.如权利要求2所述的一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPx1突变体的制备方法，其特征在于：活化的直链状单甲氧基聚乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏景艳，张广远，宋健，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22