烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用制造技术

本发明专利技术提供了烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用，属于烟草盐胁迫技术领域。所述烟草POD63蛋白具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。编码权利要求1所述的烟草POD63蛋白的基因具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。重组载体包含所述的基因。所述的烟草POD63蛋白、所述的基因或所述的重组载体在烟草抗盐胁迫反应中的应用。实验表明烟草的POD63基因超量表达后能够提高烟草抵抗盐胁迫的能力。

【技术实现步骤摘要】
烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用
本专利技术属于烟草盐胁迫
，具体涉及烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用。
技术介绍
植物过氧化物酶(peroxidase，POD)家族基因在逆境响应过程中具有重要功能。目前已经从许多植物(拟南芥，水稻，小桐子等)中克隆到这个家族基因(Tognolli，2002；Passardi，2004；王海波，2017)。例如，小桐子POD73受低温诱导表达显著，银杏POD1受植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)、金属离子铜(Cu)和镉(Cd)以及甲基紫晶(MV)和伤害处理(WOU)的处理显著诱导(程华等，2010)。对于烟草来说，POD基因序列并未有过报道，同时烟草POD基因的生物学功能也不清楚。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用，揭示烟草POD63蛋白的生物学功能。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。本专利技术提供了一种编码所述的烟草POD63蛋白的基因，具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种重组载体，包含所述的基因。本专利技术提供了一种重组菌，包含所述基因或所述的重组载体。本专利技术提供了所述烟草POD63蛋白、所述基因或所述重组载体在烟草抗盐胁迫反应中的应用。优选的，所述盐胁迫反应中盐包括氯化钠溶液或氯化钾溶液。优选的，所述盐的浓度优选为100～1000mmol/L。本专利技术提供了一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。实验结果表明，将所述烟草POD63蛋白在普通烟草品种K326中进行遗传转化，得到3个转基因的阳性株系；将这3个转基因的阳性株系与对照普通烟草K326进行氯化钠溶液的盐胁迫处理，与未转化有POD63蛋白的烟草(普通烟草K326)幼苗相比，3个转基因株系的相关生理指标(叶绿素含量、可溶性糖含量及钾含量)均明显高于对照，而丙二醛含量、钠含量则明显比对照低；在正常的生长条件，3个转基因株系与对照的上述生理指标(包括钾、钠含量)没有明显差异。这表明烟草的POD63基因超量表达后能够提高烟草抵抗盐胁迫的能力。本专利技术提供了一种编码所述的烟草POD63蛋白的基因，具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。所述基因是由GenBank收录的烟草过氧化物酶蛋白基因(登录号是XP_016440067.1)为模板设计引物扩增得到。基因核苷酸序列全长990bp。实验表明将所述基因在烟草中过量表达，具有明显的抗盐胁迫的作用。附图说明图1为编码烟草POD63蛋白的基因扩增电泳图；图2为转基因烟草的耐盐性表型观察(盆栽大苗)；图3为转基因烟草耐盐性表型观察(皿上幼苗)；图4为转基因烟草表达量检测；图5为叶绿素含量测定结果；图6为丙二醛含量测定结果；图7为可溶性糖含量测定结果；图8为钾含量测定结果；图9为钠含量测定。具体实施方式本专利技术提供了一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。所述烟草POD63蛋白的制备方法包括委托公司按照氨基酸序列进行合成或者通过构建外源重组蛋白的表达系统得到。本专利技术提供了一种编码所述的烟草POD63蛋白的基因，具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。在本专利技术中，所述基因的来源优选采用GenBank收录的烟草过氧化物酶蛋白基因(登录号是XP_016440067.1)为模板设计引物扩增得到。所述引物包括NtPOD63-F和NtPOD63-R。所述NtPOD63-F具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。所述NtPOD63-R具有如序列表中SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。本专利技术对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成公司即可。所述扩增以烟草的总RNA反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增，得到目标片段。所述扩增的反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环。所述扩增的反应体系如下：2×PCRMasterMix5μL，NtPOD63-F0.5μL，NtPOD63-R0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O3μL。本专利技术提供了一种重组载体，包括所述的基因。在本专利技术中，所述重组载体的制备方法，优选包括以下步骤：(1)将上述方案中扩增的目标片段与pMD19-T载体16℃连接过夜，得到连接产物；所述连接的反应体系为10μL，具体包括以下含量的组分：SolutionI，5μL；pMD19-T0.5μL；目的基因4.5μL；(2)将所述连接产物转化感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养基上进行筛选，采用菌落PCR检测得到阳性克隆；(3)将所述阳性克隆和表达载体PBI121分别进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切，连接，得到重组载体。在本专利技术中，所述酶切的反应体系为10μL，具体包括以下含量的组分：10×TBuffer1μL；BSA1μL；XbaI1μL；SmaI1μL；载体4μL；ddH2O2μL。所述酶切的程序优选为37℃水浴反应5h。所述连接的反应体系为10μL，具体包括以下含量的组分：SolutionI，5μL；PBI121载体0.5μL；目的基因4.5μL。所述连接的反应程序为16℃连接8h。本专利技术提供了一种重组菌，包含所述基因或所述的重组载体。所述重组菌中的宿主菌优选为农杆菌。本专利技术对所述农杆菌的菌株没有特殊限制，采用本领域所熟知的农杆菌菌株即可。本专利技术对所述重组菌的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组菌的制备方法即可。本专利技术提供了所述烟草POD63蛋白、所述基因或所述重组载体在烟草抗盐胁迫反应中的应用。在本专利技术中，所述烟草抗盐胁迫反应的方法，是将所述烟草POD63蛋白、所述基因或所述重组菌株利用农杆菌转化法导入烟草中，使烟草具有抗盐胁迫反应的作用。在本专利技术中，所述盐胁迫反应中盐优选包括氯化钠溶液或氯化钾溶液。所述盐的浓度优选为100～1000mmol/L，更优选为200～800mmol/L。下面结合实施例对本专利技术提供的烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例11.基因克隆取0.5g烟草新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA。然后，采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA。根据利用Primer5.0软件设计的全长引物(NtPOD63-F，NtPOD63-R)，采用PCR技术，进行基因全长的扩增。目的基因扩增结果如图1，片段长度约为1000bp，目的片段纯化后，与pMD19-T载体16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，随后在涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，采用菌落PCR检测阳性克隆。检测后随机选取3个独立的阳性克隆送生物技术公司进行测序。测序结果表明，该基因长度为990bp。实施例2目的基因连接表达载体酶切：将上述转化好的T-载体与表达载体PBI121分别进行双酶切(酶切位点为：XbaⅠ和SmaⅠ)。酶切体系10μL：10×TBuffer1μL；BSA1μL；X本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。2.一种编码权利要求1所述的烟草POD63蛋白的基因，具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述基因或权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁黎明，李立芹，杨尚谕，鲁逸飞，蒋垚，童铸，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51