一种生产A82846B的基因工程菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生产A82846B的基因工程菌，即在出发菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的基因组中整合了内源卤化酶基因chaA，或者与内源卤化酶基因chaA同源性不小于84％的外源卤化酶基因的工程菌。本发明专利技术还公开了上述基因工程菌的制备方法，及将上述基因工程菌发酵且从发酵液中获得A82846B的方法。本发明专利技术基因工程菌过表达导入的卤化酶基因并生产A82846B，其A82846B的产量(mg/L)或目的产物在总产物中的占比有显著地提高，本发明专利技术提高了生产效率及降低生产成本的同时，还减少了环境污染。

【技术实现步骤摘要】
一种生产A82846B的基因工程菌及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种生产A82846B的基因工程菌及其构建/制备方法与应用。
技术介绍
随着抗菌药物应用的增多，细菌的耐药性问题日益严重，耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)在皮肤感染中的比例逐年上升。临床通常使用糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁等治疗由MRSA引起的严重感染。然而，耐万古霉素菌株的迅速出现，使得寻找新型抗MRSA抗菌药物迫在眉睫。奥利万星(oritavancin)是第二代糖肽类抗生素，于2014年8月由美国FDA批准上市，用于治疗敏感革兰氏阳性菌(包括MRSA)引起的急性细菌性皮肤和结构感染，是继万古霉素和替考拉宁等第一代糖肽类抗生素之后的新型有效的抗生素。A82846B是奥利万星的合成前体，分子式是C86H97Cl2N10O26，它是万古霉素的结构类似物，结构与多数糖肽类抗生素的结构类似。目前，大规模微生物发酵法是生产A82846B的主要方式，发酵液还会有A82846A和A82846C产生。A82846A和A82846C都是A82846B的结构类似物，三者的结构式如下式1所示，三者的区别在于糖肽骨架的2位和6位氨基酸残基的取代基上的氯原子，A82846B在2和6位取代基上各有一个氯原子，A82846A只在2位取代基有一个氯原子，A82846C没有氯原子(表1)。抗菌活性依次是A82846B>A82846A>A82846C。氯原子能促使抗生素形成二聚体，形成活性口袋，更利于与细菌结合，因此含有两个氯的A82846B抗菌活性更强。发酵液中A82846A和A82846C产生，给A82846B的生产和后续的分离纯化增加了成本。表1.A82846三种产物R1和R2位点的基团组成
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中上述A82846B发酵过程中，副产物A82846A和A82846C产生，给生产A82846B及后续的分离纯化增加时间及经济成本等缺陷；提供一种生产A82846B的基因工程菌及其构建方法和应用，可以利用基因工程技术提高生产A82846B的效率，降低成本。随着分子生物学技术的发展，利用基因工程手段能够定向改造或修饰抗生素的生物合成基因簇，获得新型抗生素或提高抗生素产量。然而，本专利技术的难点在于A82846B目标产物及其副产物A82846A和A82846C的产生在其生产菌中的基因调控机理尚未清楚，特别是A82846A、A82846B与A82846C间的相互转化，以及与其内部存在的卤化酶的关系均不清楚。本专利技术通过诸多研究和试验，发现将内源卤化酶基因导入产A82846B的宿主菌，使之过表达，或在宿主菌中外源表达与该内源卤化酶基因同源性较高的卤化酶基因，将A82846A和A82846C转化为A82846B，获得的工程菌产物中各物质的含量发生了变化，副产物A82846A和A82846C的产量和/或比例显著降低，和/或A82846B产量和/或比例明显提高。因此，本专利技术的技术方案之一是：一种生产A82846B的基因工程菌，其是在生产A82846B的出发菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)的基因组中整合了内源卤化酶基因chaA，或者与所述内源卤化酶基因chaA同源性为约84％或84％以上且来源于糖肽类抗生素生产菌的外源卤化酶基因的工程菌。所述外源卤化酶基因优选来源于放线菌纲(Actinobacteria)；更优选拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)或游动放线菌属(Actinoplanes)。进一步优选地，所述拟无枝酸菌属是东方拟无枝酸菌或地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsisbalhimycina)；和/或，所述的游动放线菌属是替考游动放线菌(Actinoplanesteichomyceticus)或游动放线菌(Actinoplanessp.)。根据本专利技术，所述的卤化酶基因chaA优选来源于东方拟无枝酸菌NRRL18099菌株，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示(GeneBank编号AJ223998.1)。所述外源卤化酶基因是来源于东方拟无枝酸菌ATCC10007的万古霉素(vancomycin)卤化酶基因vcm8，其核苷酸序列优选如SEQIDNo.2所示；地中海拟无枝酸菌DSM5908的巴新霉素(balhimycin)卤化酶基因bhaA，其核苷酸序列优选如SEQIDNo.3所示；替考游动放线菌ATCC31131的替考拉宁卤化酶基因thaA，其核苷酸序列优选如SEQIDNo.4所示；或游动放线菌(Actinoplanessp.)ATCC53533的卤化酶基因halI基因，其核苷酸序列优选如SEQIDNo.5所示。根据本专利技术，所述生产A82846B的出发菌东方拟无枝酸菌可以选择常规产A82846B的天然菌株或其突变菌株，更优选为NRRL18099天然菌株。本专利技术在一较佳实施例中，是在宿主菌NRRL18099中导入东方拟无枝酸菌NRRL18099的卤化酶基因chaA，使卤化酶过表达。本专利技术在一较佳实施例中，是在宿主菌NRRL18099中导入东方拟无枝酸菌ATCC10007的万古霉素(vancomycin)卤化酶基因vcm8，使卤化酶过表达。本专利技术在又一较佳实施例中，是在宿主菌NRRL18099中导入地中海拟无枝酸菌DSM5908的balhimycin卤化酶基因bhaA，使卤化酶过表达。本专利技术的再一较佳实施例是在宿主菌NRRL18099中导入替考游动放线菌ATCC31131的teicoplanin卤化酶基因thaA，使卤化酶过表达。本专利技术的另一较佳实施例是在宿主菌NRRL18099中导入游动放线菌ATCC53533的卤化酶基因halI，使卤化酶过表达。本专利技术的再一技术方案是：一种本专利技术上述基因工程菌的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：1)PCR扩增或人工合成chaA、vcm8、bhaA、thaA或halI卤化酶全基因；2)构建chaA、vcm8、bhaA、thaA或halI的重组质粒；3)将构建的重组质粒转化到中间宿主菌；4)将带有重组质粒的中间宿主菌和生产A82846B的出发菌接合培养。较佳地，所述重组质粒的骨架为permE152质粒或pSET152；优选地，所述的中间宿主菌为大肠杆菌ET12567/pUZ8002；进一步优选地，所述的培养为在MS琼脂培养基培养，温度为28℃。本专利技术的另一技术方案是：一种A82846B的制备方法，包括将上述任一种基因工程菌发酵，从发酵液中获得A82846B。培养发酵方法可以选用现有A82846B生产菌、特别是东方拟无枝酸菌的培养发酵方法。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术通过在A82846B的生产菌东方拟无枝酸菌中过表达内源的卤化酶基因chaA及外源的vancomycin卤化酶基因vcm8、balhimycin卤化酶基因bhaA、teicoplanin卤化酶基因thaA和halI基因等，可以将A82846A和A8284本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产A82846B的基因工程菌，其特征在于，其是在生产A82846B的出发菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的基因组中整合了内源卤化酶基因chaA，或者与所述内源卤化酶基因chaA同源性不小于84％且来源于糖肽类抗生素生产菌的外源卤化酶基因的工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种生产A82846B的基因工程菌，其特征在于，其是在生产A82846B的出发菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)的基因组中整合了内源卤化酶基因chaA，或者与所述内源卤化酶基因chaA同源性不小于84％且来源于糖肽类抗生素生产菌的外源卤化酶基因的工程菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述外源卤化酶基因来源于放线菌纲(Actinobacteria)。3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的放线菌纲为拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)或游动放线菌属(Actinoplanes)。4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述拟无枝酸菌属是东方拟无枝酸菌或地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)；和/或，所述的游动放线菌属是替考游动放线菌(Actinoplanesteichomyceticus)或游动放线菌(Actinoplanessp.)。5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述外源卤化酶基因是来源于东方拟无枝菌的vcm8、地中海拟无枝酸菌的bhaA、替考游动放线菌的thaA或游动放线菌的halI基因。6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述的卤化酶基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少欣，王伟艳，马巧慧，沈晓放，杨松柏，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海,31