一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2‑km‑Papra‑lipAB，采用Red/ET直接克隆技术将B.glumae PG1基因组中的脂肪酶操纵子lipAB直接克隆至载体p15A‑cm上，通过亚克隆技术替换克隆载体上的复制子和选择性标记基因，并将lipA基因的ATG前面200bp的序列替换为apra+rbs(921bp)，使脂肪酶操纵子lipAB位于Papra的调控下，最终获得脂肪酶表达载体pRK2‑km‑Papra‑lipAB；将脂肪酶表达载体转化入B.glumae PG1中得到。其对脂肪酶底物三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯显示出较高的水解能力。

A lipase producing engineering strain, its construction method and Application

The present invention discloses a Lipase-producing engineering bacterium PG1/pRK2_km_Papra_lipAB. The lipase operon lipAB in the genome of B.glumae PG1 was cloned directly onto the carrier p15A_cm by Red/ET direct cloning technology, and the replicator and selective marker genes on the cloning vector were replaced by subcloning technology, and the AT of lipA gene was cloned. The first 200 bp sequence of G was replaced by APRA + RBS (921 bp), and lipase operon lipAB was located under the control of Papra. The lipase expression vector pRK2 km Papra lipAB was finally obtained, and the lipase expression vector was transformed into B. glumae PG1. It showed high hydrolysis ability to tributyrate and p-nitrophenol palmitate, the substrate of lipase.

【技术实现步骤摘要】
一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用
本专利技术涉及一株产脂肪酶工程菌，具体涉及一株产脂肪酶工程菌、其构建方法和应用。属于生物

技术介绍
荚壳伯克氏菌Burholderiaglumae(原名为Pseudomonasglumae)为革兰氏阴性菌，属于β-变形杆菌亚门内的伯克氏菌属，是温和的水稻病原菌，是富有运动性、好氧性、棒状的土壤细菌，它产生的毒黄素能减弱水稻幼苗根和叶的生长，能感染水稻穗从而引起穗枯病，导致水稻减产。BurholderiaglumaePG1它是重要的脂肪酶生产菌，分泌的脂肪酶能真正应用于工业生产，它产生的脂肪酶属于I.2家族的α/β水解酶，它的活性催化三联体是由Ser-Asp-His氨基酸残基构成。B.glumaePG1脂肪酶操纵子lipAB(GenBankaccessionnumber:AJK49931.1andAJK49932.1))，全长2138bp，编码711个氨基酸残基。胞外脂肪酶LipA是通过II型分泌系统分泌至培养基质中，LipB是脂肪酶特异性折叠酶，lipA与lipB基因同编码在lipAB操纵子中，成熟的LipA由319个氨基酸组成，大小为33.1kDa，LipB由353个氨基酸组成，大小为36.8kDa。B.glumaePG1脂肪酶LipA分泌至培养基质的过程具体如下：首先，lipA经转录翻译后，脂肪酶LipA前体的N端含有由39个氨基酸残基组成的N端信号肽序列，细胞内膜上的多亚基复合体Sec机制识别N端信号肽，将脂肪酶LipA前体从细胞质转运到周质空间，之后蛋白酶将N端信号肽切除下来，无活性的脂肪酶LipA前体在LipB以及二硫键形成蛋白Dsb的作用下装配、折叠成成熟的有活性的LipA。然后，在周质空间中，GSP蛋白识别脂肪酶LipA，被外膜上的GSP分泌素定向运至胞外，LipA从而被释放至培养基质中，其中GSP由一组复杂的蛋白组成，由至少12个分泌蛋白组成。近年来发展的基于大肠杆菌的Red/ET同源重组技术，它是指在E.coli中通过诱导来源于λ噬菌体的α、β蛋白表达从而介导同源重组的Red重组系统，以及通过诱导来源于Rac噬菌体的RecE、RecT蛋白表达从而介导同源重组的ET重组系统。在Red/ET重组的介导下，通过两端带有同源臂的线性载体可以从基因组DNA中将大片段的基因簇直接克隆下来。直接克隆(directcloning)的步骤为：首先，制备含有质粒的复制起点(ori)，选择性标记基因(sm)，两端带有相关同源臂的线性载体片段，同时，用合适的核酸内切酶对基因组DNA进行酶切，然后，将线性载体片段和酶切消化过的基因组转化到诱导表达了RecE/RecT重组酶的E.coli细胞中，带同源臂的线性载体与基因组片段上的目的DNA发生同源重组，从而在E.coli细胞中形成能自主复制的质粒，最后通过抗性筛选获得带有目的DNA的重组质粒。
技术实现思路
本专利技术的目的为构建一株新的脂肪酶同源表达菌株，对脂肪酶底物三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯显示出较高的水解能力。本专利技术提供一株Papra启动子型的脂肪酶同源表达工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB。采用Red/ET直接克隆技术将B.glumaePG1基因组中的脂肪酶操纵子lipAB直接克隆至载体p15A-cm上，获得带脂肪酶操纵子lipAB的克隆载体p15A-cm-lipAB；通过亚克隆技术替换克隆载体上的复制子和选择性标记基因，获得脂肪酶表达载体pRK2-km-lipAB；再通过Red/ETDNA同源重组技术将lipA基因的起始密码子ATG前面200bp的序列替换为apra+rbs(921bp)，使脂肪酶操纵子lipAB位于增强型启动子Papra的调控下，获得脂肪酶表达载体pRK2-km-Papra-lipAB；通过常温电转化的方法将构建的这个脂肪酶表达载体转入B.glumaePG1中，获得脂肪酶同源表达工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB。分类命名：Burkholderiaglumae；荚壳伯克氏菌BurholderiaglumaePG1，突变菌株PG1/pRK2-km-Papra-lipAB，其保藏编号分别为CGMCCNO.14100(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年5月5日)。工程菌PG1/pRK2-km-Papra–lipAB主要生物学特征如下：在LB培养基上，30℃培养8h后产生单菌落，菌落黄色、圆形、中央凸起、表面光滑。细菌为需氧型的革兰氏阴性菌，菌体细胞为直杆状。本专利技术还提供一株Papra启动子型的脂肪酶同源表达工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，包括以下步骤：1)利用Red/ET直接克隆技术对B.glumaePG1基因组上的脂肪酶操纵子lipAB进行直接克隆，构建了载体p15A-cm-lipAB；2)利用Red/ET同源重组技术对含有lipAB操纵子的克隆载体p15A-cm-lipAB进行亚克隆，构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB；3)利用Red/ET同源重组技术将脂肪酶操纵子lipAB的原始启动子PlipAB替换为增强型启动子Papra，构建并筛选出重组载体GB05-dir/pRK2-km-Papra-lipAB；4)常温条件下，利用电穿孔法将来源于大肠杆菌GB05-dir中的质粒pRK2-km-Papra-lipAB转化至B.glumaePG1中，筛选出PG1/pRK2-km-Papra-lipAB工程菌。优选的，步骤1)所述构建克隆载体p15A-cm-lipAB的具体方法为：a)制备线性化的B.glumaePG1基因组DNA：用限制性内切酶EcoRV和EcoRI对PG1的基因组DNA进行双酶切，对含有lipAB操纵子的DNA片段在跑胶验证后进行沉淀回收；b)制备p15A-cm线性载体片段：以p15A-cm-tetO-hyg为模板，PG1-lipase-A/S为引物，通过PCR扩增1866bp大小的线性载体p15A-cm，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行沉淀回收；所述引物的核苷酸序列为：PG1-lipase-A：tcgacatgacacggcgcgagacgtattgcggcgcagcgcgAAGGCCGCGCTGTCGGTGAACGCTCTCTACTA，如SEQIDNO.1所示；PG1-lipase-S：gtatccgcaggtggccgatatcgtctggcggatggcgctgTGCGGGGCGGTGAGACGTTGATCGGCACGTA，如SEQIDNO.2所示；其中小写字母为同源臂，下同)，c)Red/ETDNA线性—线性同源重组(Linear-linearhomologousrecombination,LLHR)：平板上挑选GB05-dir单菌落到1mLLB培养基中，于30℃、900rpm过夜培养；取40μl过夜菌于1.3mLLB中(OD600约为0.4)，于30℃、900rpm培养1.5h后加入20μl10％阿拉伯糖溶液，于37℃、900rpm诱导培养40min(OD600约为0.4)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2‑km‑Papra‑lipAB，菌种保藏号为CGMCC NO.14100。

【技术特征摘要】
1.一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB，菌种保藏号为CGMCCNO.14100。2.权利要求1所述一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用Red/ET同源重组技术对B.glumaePG1基因组上的脂肪酶操纵子lipAB进行直接克隆，构建克隆载体p15A-cm-lipAB；2)利用Red/ET同源重组技术对lipAB操纵子进行亚克隆，构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB；3)利用Red/ET同源重组技术将脂肪酶操纵子lipAB的启动子PlipAB替换为Papra，构建并筛选出重组载体GB05dir/pRK2-km-Papra-lipAB；4)利用电穿孔法将来源于大肠杆菌GB05-dir中的质粒pRK2-km-Papra-lipAB转化至B.glumaePG1中，筛选出PG1/pRK2-km-Papra-lipAB工程菌。3.根据权利要求2所述的一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，其特征在于，步骤1)所述构建克隆载体p15A-cm-lipAB的具体方法为：a)制备线性化的B.glumaePG1基因组DNA：用限制性内切酶EcoRV和EcoRI对PG1的基因组DNA进行双酶切，对含有lipAB操纵子的DNA片段在跑胶验证后进行沉淀回收；b)制备p15A-cm线性载体片段：以p15A-cm-tetO-hyg为模板，PG1-lipase-A/S为引物，通过PCR扩增1866bp大小的线性载体p15A-cm，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行沉淀回收；所述引物的核苷酸序列为：PG1-lipase-A：tcgacatgacacggcgcgagacgtattgcggcgcagcgcgAAGGCCGCGCTGTCGGTGAACGCTCTCTACTA，如SEQIDNO.1所示；PG1-lipase-S：gtatccgcaggtggccgatatcgtctggcggatggcgctgTGCGGGGCGGTGAGACGTTGATCGGCACGTA，如SEQIDNO.2所示；c)LLHR:挑选GB05-dir单菌落，分别加入2μg线性化的PG1基因组DNA和p15A-cm线性载体片段1μg，于30℃、900rpm复苏1h；室温9000rpm离心30s，倒去上清，用枪头打匀后涂于LB平板，置于37℃过夜培养；d)克隆载体p15A-cm-lipAB的鉴定：对LB平板上长出的单克隆随机挑取进行质粒提取，并对酶切验证正确的单克隆进行分管冻存。4.根据权利要求3所述的一株产脂肪酶工程菌PG1/pRK2-km-Papra-lipAB的构建方法，其特征在于，步骤2)所述构建工程菌株GB05-dir/pRK2-km-lipAB的具体方法为：a)制备线性化载体pRK2-kan:以pRK2-kan-apra为模板，以RK2-kan-A/S为引物通过PCR扩增3194bp的线性载体pRK2-km，对PCR扩增产物跑胶验证正确后进行切胶回收；所述引物的核苷酸序列为：RK2-km-A：atgctgcggcgcgcaagcgggcgcgatcgatccggtgaatCACTGAGCGTCTAGCGTTTG，如SEQIDNO.3所示；RK2-km-S：gccgcgagcgagcaagaatcacgacgctctgcaacaatgcGCTCGCCAGTCGATTGGCTGA，如SEQIDNO.4所示；b)制备线性化载体p15A-cm-lipAB：提取质粒p15A-cm-lipAB，并以EcoRV对质粒进行单酶切和跑胶验证，对大小约为4.9kb的酶切条带进行切胶回收；...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂强，张友明，方倩，边志龙，刘峰，潘登，
申请(专利权)人：山东大学苏州研究院，山东大学，德州迈科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32