一种近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法和SNP位点及其引物技术

本发明专利技术公开了一种近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法，首先SNP panel设计：选取近交系小鼠品系，筛选与其它品系特异性区分位点和常规遗传质量监控位点，前者以染色体为单位，SNP panel中应包括至少5对含特异性区分位点的染色体，且每对染色体应含有2个以上特异性区分位点；后者在特异性区分位点的基础上，按照每对染色体4‑5个等间距位点原则将SNP panel的位点补足为96个；然后设计SNP位点引物；再提取样本DNA，用KASP法进行基因分型，并与NCBI上的SNP位点信息比较，完成近交系小鼠遗传质量监控。本发明专利技术还公开了一种近交系遗传质量监控的SNP位点及SNP位点引物。

【技术实现步骤摘要】
一种近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法和SNP位点及其引物
本专利技术属于近交系小鼠品系遗传背景鉴定与遗传污染检测领域，涉及一种近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法，尤其涉及一种基于KASP法进行SNP分型的检测方法及SNP位点和其引物。
技术介绍
实验动物质量控制是实验动物行业健康发展的核心问题，小鼠微生物质量控制及遗传背景质量控制是其中的重要控制因素。国内的遗传质量监控缺少成熟的行业标准，建立一种快速且精准性高的高通量基因分型技术平台至关重要。用于遗传背景质量控制检测方法主要有3种：生化标记分析法、微卫星DNA、SNP(单核苷酸的多态性)检测等。目前国际所规定的遗传检测方法是生化标记分析法，这一方法是检测同工酶或异构蛋白酶的变化来推测相应的基因变化；使用此方法进行检测，存在准确度低、灵敏度低、检测位点有限、反映遗传概貌有限等弊端。而分子遗传标记可以对实验动物进行更精细的监管，是一种更完善的实验动物质量检测手段；其中SNP检测作为分子遗传标记的一门技术，在基因组水平上检测由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性；SNP所表现的多态性可以监测到单个碱基的变异，具有密度高、代表性、遗传稳定性等特点，能够全面地反映基因组的遗传及变异情况。KASP法是指竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAlleleSpecificPCR)，以高灵敏度的荧光检测为基础，对目标SNPs进行精准的双等位基因分型。与传统Taqman技术不同的是，此种方法无需对靶点即特异性引物/探针进行标记，不需要根据每个SNP位点合成特异的荧光引物，其独特的ARMPCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了实验成本。优化的PCR体系可满足不同位点高通量反应的需求，既有金标准的准确，又降低了使用成本，比Taqman具有更好的位点适应性。KASP技术将传统检测等位基因的2个反应合成了1个反应，成本低。SNPs检测不但弥补了传统PCR、切胶、测序流程时间长的缺点，而且大大节省了测序的费用。
技术实现思路
目前的SNP检测panel由于受到操作技术及检测成本的制约，导致样本检测通量较低、位点的选择受到限制，针对现有技术中存在的缺点，本专利技术的目的在于提供一种高通量、多位点、低成本、快速用于近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法本专利技术的目的还在于提供一组位点在近交系遗传质量监控中作为的SNP位点的应用。本专利技术的目的还在于提供一种近交系遗传质量监控的SNP位点引物。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法，包括如下步骤：(1)SNPpanel的设计：确定近交系小鼠品系，筛选出C57BL/6品系与其它品系的可特异性区分位点和品系常规遗传质量监控位点，所述特异性区分位点如下：C57BL/6品系位点的碱基与129S1/SvIm、BALB/C、A/J、CBA、DBA、FVB、NOD品系中对应的碱基不同，以染色体为单位，SNPpanel中应包括至少5对含特异性区分位点的染色体，且每对染色体应含有2个以上特异性区分位点；所述品系常规遗传质量监控位点如下：在所述特异性区分位点的基础上，按照每对染色体上4-5个位点原则，等间距地进行位点的补足，将C57BL/6品系的SNPpanel位点补足为96个；所述SNPpanel可用于C57BL品系近交系小鼠及相应突变系小鼠的遗传质量检测及品系污染情况检测以及C57BL品系小鼠与其他品系的有效鉴别；(2)设计并合成上述SNPpanel位点的引物，不需设计探针；SNPpanel位点上下游序列各100bp序列使用编程工具在小鼠基因组序列中进行拉取；其中，5’端上游引物设计：5’端上游引物共有两条，均包括引物前体和一段可识别FAM或HEX信号的序列；所述引物前体设在每个SNPpanel位点的上游，长度为20-30bp，在引物前体的末端分别为SNPpanel位点的两个突变碱基；所述可识别FAM或HEX信号的序列设在所述引物前体的5’端，长度约为20bp；3’端下游引物为一条，其长度约18-29bp；将上述3条引物同时进行PCR扩增，若体系中产生其中一个信号，则说明样品模板中含有该碱基突变类型；对96个位点使用对照品系129S1/Svlm亚系129S1/SvlmJNju及C57BL/6亚系C57BL/6JNju进行引物测试，若成功分型，则表示引物测试成功，否则对测试失败的位点在染色体相应位置的上下游寻找替换位点；测试成功的96个位点及PCR引物测试条件及体系确定为最终检测方案；(3)提取待测样本DNA，样品浓度大于10ng/uL时，用KASP法对每个样本的96个SNPpanel位点进行基因分型，分析数据并与NCBI上的SNP位点信息比较，完成近交系小鼠遗传质量监控与品系鉴定。进一步地，所述步骤(1)中，近交系小鼠品系为A/J、129S1/SvIm、BALB/C、C57BL/6、CBA、DBA、FVB、NOD；所述C57BL/6品系与其他7个品系的特异性可区分位点有69个，具体如下：进一步地，所述步骤(3)中，待测样本DNA的浓度需求＝5ng/uL×待测物种基因组大小/人类基因组大小。进一步地，所述KASP法的反应体系如下：包括DNA(5-50ng/uL，以人或小鼠为例)在每个反应孔的体积为0.8uL，2×KASPMastermix在每个反应孔的体积为0.778uL，KASPPrimermix在每个反应孔的体积为0.022uL。进一步地，所述KASP法的反应程序如下：或或一组96个位点在近交系遗传质量监控中作为SNP位点的应用，所述96个位点如下：*为特异性区分位点。一种近交系遗传质量监控的SNP位点引物，所述引物序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.288所示。本专利技术具有的有益效果如下：本专利技术检测方法完成1个项目的36个样品的位点检测(每个样品检测96个位点)，需要的总周期仅仅为6个工作日。本专利技术方法提高了单个样品的可检测位点数、而且高通量检测使得实验周期大大缩短，此外在提高通量的同时保证了结果的准确性。本专利技术使用的C57BLSNPpanel共含有96个位点，除用于C57BL品系及相关突变品系的常规遗传质量监控外，可用于与A/J、129S1/SvIm、BALB/C、CBA、DBA、FVB、NOD品系的区分。本专利技术使用无需对靶点即特异性引物进行标记，不需要设计探针，不需要根据每个SNP位点合成特异的荧光引物，所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，不需要传统PCR的跑胶、切胶、测序等流程，节省了检测时间，而且大大节省了测序的费用；此外KASP法对目标SNPs进行双等位基因分型，将传统检测等位基因的2个反应合成了1个反应，成本降低。附图说明图1为本专利技术检测方法的流程图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的说明。本实施例的近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法，其流程如图1所示，具体步骤详见如下：实施例1：SNPpanel设计1、确定SNPpanel中包含的近交品系选取13种近交系小鼠品系进行常规SNP检测(如表1)，13种近交系小鼠品系均由南京大学-南京生物医药研究院(NBRI)提供(公开销售)，在筛选过程中发现，C57BL/6J与C57本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)SNP panel的设计：确定近交系小鼠品系，筛选出C57BL/6品系与其它品系的可特异性区分位点和品系常规遗传质量监控位点，所述特异性区分位点如下：C57BL/6品系位点的碱基与129S1/SvIm、BALB/C、A/J、CBA、DBA、FVB、NOD品系中对应的碱基不同，以染色体为单位，SNP panel中应包括至少5对含特异性区分位点的染色体，且每对染色体应含有2个以上特异性区分位点；所述品系常规遗传质量监控位点如下：在所述特异性区分位点的基础上，按照每对染色体上4‑5个位点原则，等间距地进行位点的补足，将C57BL/6品系的SNP panel位点补足为96个；所述SNP panel可用于C57BL品系近交系小鼠及相应突变系小鼠的遗传质量检测及品系污染情况检测以及C57BL品系小鼠与其他品系的有效鉴别；(2)设计并合成上述SNP panel位点的引物，不需设计探针；SNP panel位点上下游序列使用编程工具在小鼠基因组序列中进行拉取；其中，5’端上游引物设计：5’端上游引物共有两条，均包括引物前体和一段可识别FAM或HEX信号的序列；所述引物前体设在每个SNP panel位点的上游，长度为20‑30bp，在引物前体的末端分别为SNP panel位点的两个突变碱基；所述可识别FAM或HEX信号的序列设在所述引物前体的5’端，长度约为20bp；3’端下游引物为一条，其长度约18‑29bp；将上述3条引物同时进行PCR扩增，若体系中产生其中一个信号，则说明样品模板中含有该碱基突变类型；对96个位点使用对照品系进行引物测试，若成功分型，则表示引物测试成功，否则对测试失败的位点在染色体相应位置的上下游寻找替换位点；测试成功的96个位点及PCR引物测试条件及体系确定为最终检测方案；(3)提取待测样本DNA，样品浓度大于10ng/uL时，用KASP法对每个样本的96个SNP panel位点进行基因分型，分析数据并与NCBI上的SNP位点信息比较，完成近交系小鼠遗传质量监控与品系鉴定。...

【技术特征摘要】
1.一种近交系遗传质量监控的SNP快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)SNPpanel的设计：确定近交系小鼠品系，筛选出C57BL/6品系与其它品系的可特异性区分位点和品系常规遗传质量监控位点，所述特异性区分位点如下：C57BL/6品系位点的碱基与129S1/SvIm、BALB/C、A/J、CBA、DBA、FVB、NOD品系中对应的碱基不同，以染色体为单位，SNPpanel中应包括至少5对含特异性区分位点的染色体，且每对染色体应含有2个以上特异性区分位点；所述品系常规遗传质量监控位点如下：在所述特异性区分位点的基础上，按照每对染色体上4-5个位点原则，等间距地进行位点的补足，将C57BL/6品系的SNPpanel位点补足为96个；所述SNPpanel可用于C57BL品系近交系小鼠及相应突变系小鼠的遗传质量检测及品系污染情况检测以及C57BL品系小鼠与其他品系的有效鉴别；(2)设计并合成上述SNPpanel位点的引物，不需设计探针；SNPpanel位点上下游序列使用编程工具在小鼠基因组序列中进行拉取；其中，5’端上游引物设计：5’端上游引物共有两条，均包括引物前体和一段可识别FAM或HEX信号的序列；所述引物前体设在每个SNPpanel位点的上游，长度为20-30bp，在引物前体的末端分别为SNPpanel位点的两个突变碱基；所述可识别FAM或HEX信号的序列设在所述引物前体的5’端，长度约为20bp；3’端下游引物为一条，其长度约18-29bp；将上述3条引物同时进行PCR扩增，若体系中产生其中一个信号，则说明样品模板中含有该碱基突变类型；对96个位点使用对照品系进行引物测试，若成功分型，则表示引物测试成功，否则对测试...

【专利技术属性】
技术研发人员：琚存祥，赵静，马秀英，张明坤，侯欢欢，高翔，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32