一种棉花遗传转化方法技术

本发明专利技术属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种棉花遗传转化方法，包括如下步骤：制备转化受体、制备侵染液、侵染、共培养、筛选、胚性愈伤诱导培养、苗诱导，得到棉花的带有KANA抗性基因的棉花遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的棉花转基因植株。

A method of cotton genetic transformation

The invention belongs to the technical field of plant genetic transformation, and in particular provides a method for cotton genetic transformation, including the following steps: preparation of transformation receptor, preparation of infection liquid, infection, co-culture, screening, embryogenic callus induction culture, seedling induction, and obtaining cotton genetic transformation plants with KANA resistance genes. The method is simple, easy to operate, parameter and medium optimization, and can obtain transgenic cotton plants with high genetic transformation rate in a relatively short time.

【技术实现步骤摘要】
一种棉花遗传转化方法
本专利技术属于植物遗传转化
，特别提供了一种棉花遗传转化方法。
技术介绍
棉花是我国的非起源作物，因此我国的棉花种质资源较为匮乏，利用遗传转化技术将外源基因导入棉花基因组内，不仅可以有效打破物种间的界限，还能增加棉花的品种，提高棉花抗性。但是目前的棉花遗传转化方法均存在着遗传转化率低、转化时间长等问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种棉花遗传转化方法，通过调整过程中的培养基及培养参数，大大缩短了棉花遗传转化的时间，并且提高了遗传转化率。本专利技术是这样实现的，提供一种棉花遗传转化方法，包括如下步骤：1)制备转化受体棉花种子的灭菌：选取脱绒后的棉花种子用70％的乙醇灭菌1min，之后用15％的过氧化氢灭菌4h，最后用无菌水清洗3-5次；预培养：用灭菌滤纸吸干种子表面水分，放到GS1培养基上，28℃培养室中避光培养6天，至下胚轴的长度在9-11cm；2)制备侵染液取50mLGs-inf，将农杆菌挑至Gs-inf中，制成侵染液；3)侵染切取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5cm小段，将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴，以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的Gs-cocu培养基上培养两天，至下胚轴变为淡黄色；5)筛选第一次筛选：将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基Gs2-1中筛选40天；第二次筛选：第一次筛选后，将下胚轴转入到筛选培养基Gs2-1中筛选30-40d，直到筛选到大块初级愈伤；6)胚性愈伤诱导培养将步骤5)获得的初级愈伤接入Gs3培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有胚长出；7)苗诱导将步骤6)得到的胚继代到Gs4培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有生根好的苗长出，至少长出3根根系，3片叶绿色叶子；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中各个代码含义为：。进一步地，所述步骤2)中制备的侵染液OD600＝1.0。选用的农杆菌为LBA4404，携带的为KANA抗性基因。进一步地，所述棉花的品种为R15或Xu142中的一种。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的棉花转基因植株。附图说明图1为利用本专利技术的方法获得的共培养阶段的下胚轴；图2为利用本专利技术的方法获得的第一次筛选阶段的愈伤组织；图3为利用本专利技术的方法获得的第二次筛选阶段的愈伤组织；图4为利用本专利技术的方法获得的胚性愈伤；图5为利用本专利技术的方法获得的胚；图6为利用本专利技术的方法获得的芽；图7为利用本专利技术的方法获得的伸长的芽；图8为利用本专利技术的方法获得的生根的苗。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例、1)制备转化受体棉花种子的灭菌：取50粒棉花种子(R15或Xu142)，用50mL70％的乙醇灭菌1min，之后用50mL15％的过氧化氢灭菌4h，最后用无菌水清洗3-5次；预培养：用灭菌滤纸吸干种子表面水分，放到GS1培养基上，28℃培养室中避光培养6天，至下胚轴的长度在9-11cm；2)制备侵染液取50mLGs-inf，将携带KANA抗性基因的LBA4404农杆菌挑至Gs-inf中，制成侵染液，OD600＝1.0；3)侵染切取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5cm小段，将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴，以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的Gs-cocu培养基上，至下胚轴变为淡黄色，参考图1；5)筛选第一次筛选：将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基Gs2-1中筛选40天，参考图2；第二次筛选：第一次筛选后，将下胚轴转入到筛选培养基Gs2-1中筛选30-40天，直到筛选到大块初级愈伤，参考图3；6)胚性愈伤诱导培养将步骤5)获得的初级愈伤接入Gs3培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有胚长出，参考图4和图5；7)苗诱导将步骤6)得到的胚继代到Gs4培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有生根好的苗长出，至少长出3根根系，3片叶绿色叶子，参考图6、图7和图8；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种棉花遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备转化受体棉花种子的灭菌：选取脱绒后的棉花种子用70％的乙醇灭菌1min，之后用15％的过氧化氢灭菌4h，最后用无菌水清洗3‑5次；预培养：用灭菌滤纸吸干种子表面水分，放到GS1培养基上，28℃培养室中避光培养6天，至下胚轴的长度在9‑11cm；2)制备侵染液取50mL Gs‑inf，将农杆菌挑至Gs‑inf中，制成侵染液；3)侵染切取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5cm小段，将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴，以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的Gs‑cocu培养基上培养两天，至下胚轴变为淡黄色；5)筛选第一次筛选：将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基Gs2‑1中筛选40天；第二次筛选：第一次筛选后，将下胚轴转入到筛选培养基Gs2‑1中筛选30‑40d，直到筛选到大块初级愈伤；6)胚性愈伤诱导培养将步骤5)获得的初级愈伤接入Gs3培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有胚长出；7)苗诱导将步骤6)得到的胚继代到Gs4培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有生根好的苗长出，至少长出3根根系，3片叶绿色叶子；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：...

【技术特征摘要】
1.一种棉花遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备转化受体棉花种子的灭菌：选取脱绒后的棉花种子用70％的乙醇灭菌1min，之后用15％的过氧化氢灭菌4h，最后用无菌水清洗3-5次；预培养：用灭菌滤纸吸干种子表面水分，放到GS1培养基上，28℃培养室中避光培养6天，至下胚轴的长度在9-11cm；2)制备侵染液取50mLGs-inf，将农杆菌挑至Gs-inf中，制成侵染液；3)侵染切取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5cm小段，将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴，以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的Gs-cocu培养基上培养两天，至下胚轴变为淡黄色；5)筛选第一次筛选：将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基Gs2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘寒冬，
申请(专利权)人：刘寒冬，
类型：发明
国别省市：辽宁,21