一种大豆遗传转化方法技术

本发明专利技术属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：制备转化受体、制备侵染液、侵染、共培养、恢复培养、筛选、伸长培养和生根培养，得到大豆的带有抗性基因的大豆遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的大豆转基因植株。

A method of Soybean Genetic Transformation

The invention belongs to the technical field of plant genetic transformation, and in particular provides a method for soybean genetic transformation, including the following steps: preparation of transformation receptor, preparation of infection liquid, infection, co-culture, recovery culture, screening, elongation culture and rooting culture, and obtaining soybean genetic transformation plants with resistance genes. The method is simple, easy to operate, parameter and medium optimization, and can obtain transgenic soybean plants with high genetic transformation rate in a relatively short time.

【技术实现步骤摘要】
一种大豆遗传转化方法
本专利技术属于植物遗传转化
，特别提供了一种大豆遗传转化方法。
技术介绍
大豆是世界上应用最广泛的油料作物和粮食作物之一，也是人类植物性蛋白和油脂的重要来源，且大豆在生物圈氮循环中也起着重要的作用。转基因大豆是人类最早引入的商业化种植的农作物之一，也是迄今为止商业化程度最高、播种面积最大的转基因植物，可以说大豆的遗传转化技术已经相当成熟。但是目前仍然存在着转化效率低、转化时间长等问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种大豆遗传转化方法，通过调整过程中的培养基及培养参数，大大缩短了大豆遗传转化的时间，并且提高了遗传转化率。本专利技术是这样实现的，提供一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：1)制备转化受体大豆种子的灭菌：取大豆种子，用75％的乙醇灭菌5min；之后使用15％过氧化氢于摇床100rpm震荡处理12min；最后使用无菌水清洗5次；萌发培养：向灭菌后的种子中加含2mg/L6-BA的无菌水100ml，置于4℃冰箱中暗培养2天；2)制备侵染液取50ml侵染液底液，依次加入Cys100μl，HCl100μl，AS100μl，DTT50μl，ZT50μl，将混合液加入到农杆菌中，使农杆菌悬浮，制成侵染液；3)侵染取萌发的大豆，放入灭菌培养皿，切掉部分下胚轴，剥开种皮，分开两片子叶，夹住留有子叶节的子叶，观察生长点所在位置，去除两片真叶，刀尖划向生长点，划1～2刀即可，取灭菌三角瓶，向其中倒入侵染液底液，没过瓶底即可，将划好的子叶放入灭菌三角瓶中；将步骤2)制备的侵染液加至放有划好伤口的大豆子叶的三角瓶中，放置摇床100rpm侵染3h；之后取出背面朝上置于无菌滤纸上吹20min；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的子叶，接至共培养基中培养4天，子叶背面朝下，共培养基上放置一张灭菌滤纸，共培养后大豆子叶节可见一圈黑印，生长点位置长出明黄色健康芽，下胚轴生长延长；5)恢复培养将共培养后的子叶取出放置于灭菌皿中，在子叶下胚轴距子叶节5mm处切下多余的下胚轴，之后将子叶斜插入恢复培养基中恢复培养，恢复培养5-7天后，至芽生长顶到出培养基；6)筛选将恢复出的符合标准的子叶离子叶节5mm处切掉一部分下胚轴，之后插入筛选培养基中筛选15～21d，在筛选过程中，大芽上的叶子逐渐变黄，而子叶节处不断膨大且有绿色小芽不断长出；7)伸长培养将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入伸长培养基中伸长培养，至大芽叶子发黄发黑，小芽发黄；8)生根培养将伸长培养基中伸长至3-4cm的小苗剪下取出，接入生根培养基进行生根。进一步地，所述农杆菌携带的基因为bar抗性基因、epsps抗性基因或hyg抗性基因中的一种；所述大豆品种为Jack、黑农44、Williams82、DN50中的一种。进一步地，当大豆品种为Jack或DN50，且农杆菌携带的基因为bar抗性基因时，伸长培养分为一次伸长和二次伸长，侵染液底液、共培养基、恢复培养基、筛选培养基、一次伸长培养基、二次伸长培养基和生根培养基分别为J-sb-inf、J-sb-cocu、J-sb-reco、J-sbar2、J-E3bar0.5、J-E3+Tc和L5+Tc，一次伸长过程为：将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入一次伸长培养基J-E3bar0.5中15～21d，至大芽大部分叶子发黄发黑，小芽发黄；二次伸长过程为：一次伸长后接入二次伸长培养基J-E3+Tc中进行伸长培养30～45d；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：进一步地，当大豆品种为HN44或Williams82，且农杆菌携带的基因为bar抗性基因时，伸长培养分为一次伸长和二次伸长，侵染液底液、共培养基、恢复培养基、筛选培养基、一次伸长培养基、二次伸长培养基、生根培养基分别为w-sb-inf、w-sb-cocu、w-sb-reco、w-sbar2、w-E5bar0.5、w-E5+Tc和L5+Tc，一次伸长过程为：将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入一次伸长培养基w-E5bar0.5中15～21d，至大芽大部分叶子发黄发黑，小芽发黄；二次伸长过程为：一次伸长后接入二次伸长培养基w-E5+Tc中进行伸长培养30～45d；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：进一步地，当大豆品种为Williams82，且农杆菌携带的基因为epsps抗性基因时，伸长培养分为一次伸长和二次伸长，侵染液底液、共培养基、恢复培养基、筛选培养基、一次伸长培养基、二次伸长培养基、生根培养基分别为w-sb-inf、w-sb-cocu、w-sb-reco、w-SE10、w-E5E5、w-E5+Tc和L5+Tc，一次伸长过程为：将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入一次伸长培养基w-E5E5中15～21d，至大芽大部分叶子发黄发黑，小芽发黄；二次伸长过程为：一次伸长后接入二次伸长培养基w-E5+Tc中进行伸长培养30～45d；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：进一步地，当大豆品种为Jack，且农杆菌携带的基因为epsps抗性基因时，伸长培养分为一次伸长和二次伸长，侵染液底液、共培养基、恢复培养基、筛选培养基、一次伸长培养基、二次伸长培养基、生根培养基分别为J-sb-inf、J-sb-cocu、J-sb-reco、J-SE10、J-E3E5、J-E3+Tc和L5+Tc，一次伸长过程为：将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入一次伸长培养基J-E3E5中15～21d，至大芽大部分叶子发黄发黑，小芽发黄；二次伸长过程为：一次伸长后接入二次伸长培养基J-E3+Tc中进行伸长培养30～45d；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：进一步地，当大豆品种为Jack，且农杆菌携带的基因为hyg抗性基因时，侵染液底液、共培养基、恢复培养基、筛选培养基、伸长培养基、生根培养基分别为w-sb-inf、w-sb-cocu、w-sb-reco、w-SH25、w-E5+Tc和L5+Tc，伸长过程为：将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入伸长培养基w-E5+Tc中，每15～21d循环继代一次；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：进一步地，所述步骤2)中制备的侵染液OD600＝0.8-1.0。进一步地，所述农杆菌品种为EHA105。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的大豆转基因植株。附图说明图1为实施例1共培养阶段的大豆外植体；图2为实施例1恢复培养阶段的大豆外植体；图3为实施例1诱导出的阳性芽；图4为实施例1生根阶段的阳性芽。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1、(大豆品种为DN50，农杆菌携带抗性基因为bar抗性基因)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备转化受体大豆种子的灭菌：取大豆种子，用75％的乙醇灭菌5min；之后使用15％过氧化氢于摇床100rpm震荡处理12min；最后使用无菌水清洗5次；萌发培养：向灭菌后的种子中加含2mg/L 6‑BA的无菌水100ml，置于4℃冰箱中暗培养2天；2)制备侵染液取50ml侵染液底液，依次加入Cys 100μl，HCl 100μl，AS 100μl，DTT 50μl，ZT 50μl，将混合液加入到农杆菌中，使农杆菌悬浮，制成侵染液；3)侵染取萌发的大豆，放入灭菌培养皿，切掉部分下胚轴，剥开种皮，分开两片子叶，夹住留有子叶节的子叶，观察生长点所在位置，去除两片真叶，刀尖划向生长点，划1～2刀即可，取灭菌三角瓶，向其中倒入侵染液底液，没过瓶底即可，将划好的子叶放入灭菌三角瓶中；将步骤2)制备的侵染液加至放有划好伤口的大豆子叶的三角瓶中，放置摇床100rpm侵染3h；之后取出背面朝上置于无菌滤纸上吹20min；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的子叶，接至共培养基中培养4天，子叶背面朝下，共培养基上放置一张灭菌滤纸，共培养后大豆子叶节可见一圈黑印，生长点位置长出明黄色健康芽，下胚轴生长延长；5)恢复培养将共培养后的子叶取出放置于灭菌皿中，在子叶下胚轴距子叶节5mm处切下多余的下胚轴，之后将子叶斜插入恢复培养基中恢复培养，恢复培养5‑7天后，至芽生长顶到出培养基；6)筛选将恢复出的符合标准的子叶离子叶节5mm处切掉一部分下胚轴，之后插入筛选培养基中筛选15～21d，在筛选过程中，大芽上的叶子逐渐变黄，而子叶节处不断膨大且有绿色小芽不断长出；7)伸长培养将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入伸长培养基中伸长培养，至大芽叶子发黄发黑，小芽发黄；8)生根培养将伸长培养基中伸长至3‑4cm的小苗剪下取出，接入生根培养基进行生根。...

【技术特征摘要】
1.一种大豆遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备转化受体大豆种子的灭菌：取大豆种子，用75％的乙醇灭菌5min；之后使用15％过氧化氢于摇床100rpm震荡处理12min；最后使用无菌水清洗5次；萌发培养：向灭菌后的种子中加含2mg/L6-BA的无菌水100ml，置于4℃冰箱中暗培养2天；2)制备侵染液取50ml侵染液底液，依次加入Cys100μl，HCl100μl，AS100μl，DTT50μl，ZT50μl，将混合液加入到农杆菌中，使农杆菌悬浮，制成侵染液；3)侵染取萌发的大豆，放入灭菌培养皿，切掉部分下胚轴，剥开种皮，分开两片子叶，夹住留有子叶节的子叶，观察生长点所在位置，去除两片真叶，刀尖划向生长点，划1～2刀即可，取灭菌三角瓶，向其中倒入侵染液底液，没过瓶底即可，将划好的子叶放入灭菌三角瓶中；将步骤2)制备的侵染液加至放有划好伤口的大豆子叶的三角瓶中，放置摇床100rpm侵染3h；之后取出背面朝上置于无菌滤纸上吹20min；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的子叶，接至共培养基中培养4天，子叶背面朝下，共培养基上放置一张灭菌滤纸，共培养后大豆子叶节可见一圈黑印，生长点位置长出明黄色健康芽，下胚轴生长延长；5)恢复培养将共培养后的子叶取出放置于灭菌皿中，在子叶下胚轴距子叶节5mm处切下多余的下胚轴，之后将子叶斜插入恢复培养基中恢复培养，恢复培养5-7天后，至芽生长顶到出培养基；6)筛选将恢复出的符合标准的子叶离子叶节5mm处切掉一部分下胚轴，之后插入筛选培养基中筛选15～21d，在筛选过程中，大芽上的叶子逐渐变黄，而子叶节处不断膨大且有绿色小芽不断长出；7)伸长培养将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入伸长培养基中伸长培养，至大芽叶子发黄发黑，小芽发黄；8)生根培养将伸长培养基中伸长至3-4cm的小苗剪下取出，接入生根培养基进行生根。2.如权利要求1所述的大豆遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌携带的基因为bar抗性基因、epsps抗性基因或hyg抗性基因中的一种；所述大豆品种为Jack、黑农44、Williams82、DN50中的一种。3.如权利要求2所述的大豆遗传转化方法，其特征在于，当大豆品种为Jack或DN50，且农杆菌携带的基因为bar抗性基因时，伸长培养分为一次伸长和二次伸长，侵染液底液、共培养基、恢复培养基、筛选培养基、一次伸长培养基、二次伸长培养基和生根培养基分别为J-sb-inf、J-sb-cocu、J-sb-reco、J-sbar2、J-E3bar0.5、J-E3+Tc和L5+Tc，一次伸长过程为：将筛选过后的转化外植体拨掉黄叶，切掉子叶节底部表面，然后接入一次伸长培养基J-E3bar0.5中15～21d，至大芽大部分叶子发黄发黑，小芽发黄；二次伸长过程为：一次伸长后接入二次伸长培养基J-E3+Tc中进行伸长培养30～45d；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：4.如权利要求2所述的大豆遗传转化方法，其特征在于，当大豆品种为HN44或Williams82，且农杆菌携带的基因为b...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘寒冬，
申请(专利权)人：刘寒冬，
类型：发明
国别省市：辽宁,21