多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了多功能植物双元质粒pPBEL‑BiFC的构建方法及其应用，属于基因工程技术领域，该方法包括以下步骤：改造原有的多克隆位点，把原有的MCS区进行敲除，引入两段新的MCS区，可以有更多的酶切位点选择。对原有的GFP进行改造，代替GFP，引入YFP‑C段和YFP‑N段在载体的不同位置，YFP‑C段和YFP‑N段分别在两个载体的局面。引入了HA和MYC标签，能进行western‑blot蛋白检测，HA上连接A蛋白，MYC上连接B蛋白，通过检测A蛋白进行western‑blot分析，进而检测是否有B蛋白存在，反之亦然。本发明专利技术构建的质粒能进行Co‑IP免疫共沉淀反应。

Construction method and application of multifunctional plant dual plasmid pPBEL-BiFC

The invention discloses a method for constructing a multifunctional plant binary plasmid pPBEL_BiFC and its application, which belongs to the field of genetic engineering technology. The method comprises the following steps: remodeling the original polyclonal site, knocking out the original MCS region, introducing two new MCS regions, so that more enzyme digestion sites can be selected. The original GFP was reformed to replace GFP, and YFP_C and YFP_N segments were introduced in different positions of the carrier, YFP_C and YFP_N segments were respectively in two carrier situations. The labels of HA and MYC were introduced to detect Western_blot protein, HA-linked A protein and MYC-linked B protein. Western_blot analysis was carried out by detecting A protein, and then the existence of B protein was detected, and vice versa. The plasmid constructed by the invention can carry out Co - IP immunoprecipitation reaction.

【技术实现步骤摘要】
多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种用于两个不同目的蛋白质表达和互作的多功能植物双元质粒(pPBEL-BiFC)的构建方法及其应用。
技术介绍
本质粒的基本骨架是基于pCambia1302载体，但pCambia1302只能做单个基因的表达，无HA,MYC标签，不能使用通用的标签序列进行Westernblot分析。新构建的载体具有同时表达分别带有HA和Myc标签的两个不同的外源蛋白并分别与YFPN173和YFPC155同框(in-frame)表达融合蛋白，原有载体不能进行Co-IP免疫共沉淀反应，不能进行双分子荧光互补(BiFC)试验，重新分布、增加和排列了多克隆位点，两个多克隆位点区域(MCS)中每一个每个切点均是唯一的，每个多克隆位点区域(MCS1和MCS2)分别含有一个平末端酶切点SmaI和PmlI。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决原有的pCambia1302载体存在的缺陷，为了高效率进行植物蛋白质功能的研究，对只能做蛋白质在植物细胞定位的植物表达载体pCambia1302进行了系统改造，构建成新多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC，提供了一种新型的用于蛋白质表达和蛋白质互作的多功能植物载体。其具体技术方案为：多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法，包括以下步骤：步骤1.消除了原有的多克隆位点MCS区，在另外部位即HA和Myc标签的后部引入两段新的MCS区域，可以有更多的酶切位点选择，方便在这两个标签之后插入目的基因。步骤2.利用NcoI和BstEII双酶切消除原有的GFP基因和酶切点，引入HA标签序列，再紧随其后加上多克隆位点(MCS)和YFPC155序列。步骤3.用XhoI切除Hygromycin抗性基因，加上Myc从标签序列，再紧随其后加上多克隆位点(MCS)和YFPN173序列。本专利技术所述的多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。HA标签的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；多克隆位点1的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；YFPN173的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；Myc标签的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；多克隆位点2的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；YFPC155的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。本专利技术新构建的质粒具有同时在植物细胞、原生质体、组织中表达两个不同融合蛋白质，以进行生物化学、生物物理学等方面的研究。本专利技术所构建的多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC在研究蛋白质在体内(invivo)互作，揭示蛋白质新功能等方面具有全新的应用价值。本专利技术所述多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC在免疫共沉淀Co-IP和BiFC检测过程中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术改造后的质粒是2-in-1质粒，不同于普通的蛋白质互作实验需要将两个目的基因分别构建在两个不同质粒上，本专利技术新构建的新质粒可以大大简化实验程序，提高了科学研究工作效率，适用于所有可以做瞬时转化和农杆菌街道转的植物材料。用该质粒得到的产物本专利技术可以使用生物化学的方法(免疫共沉淀Co-IP)和生物物理方法(双分子荧光互补BiFC)研究两个未知蛋白之间的互作，亚细胞共定位；除蛋白质物理互作关系分析之外，构建的新质粒还可以方便做蛋白质激酶与底物磷酸化分析，蛋白质泛素连接酶与底物泛素化分析等。附图说明图1有代表性的BiFC分析图谱；图2是利用pPBEL-BiFC质粒得到的BiFC结果，其中，图2(A)为野生大豆GsSnRK1与野生大豆转录因子GsERF71H(细胞核定位)之间的互作和共定位(两蛋白互作于细胞核)，图2(B)为野生大豆GsSnRK1与水稻水孔蛋白OsPIP1；1(原生质膜定位)之间的互作和共定位(两蛋白互作于细胞质膜)；图3是利用pPBEL-BiFC质粒得到的Co-IP结果，其中图3(A)为野生大豆GsSnRK1与野生大豆转录因子GsERF71H免疫共沉淀结果，图3(B)为野生大豆GsSnRK1与水稻水孔蛋白OsPIP1；1免疫共沉淀结果。具体实施方式下面结合具体附图和实施方案对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。将YFP荧光蛋白质分成YFPN173和YFPC155两个片段，分别构建成了HA-PmlI-EcoRI-SpeI-HindIII-BamHI-NcoI-YFPN173-BstEII和Myc-SmaI-KpnI-SalI-PstI-BglII-XbaI-SacI-YFPC155-XhoI两个cassettes代替了原质粒上的GFP和Hygromycin基因，所构建的质粒能利用HA和Myc为蛋白质翻译起始并作为Westernblot通用标签，使用生物化学免疫共沉淀(Co-IP)方法鉴定两个蛋白质之间的互作关系。同时还通过利用其后的YFPN173和YFPC155分裂片段能够进行双分子荧光互补分析，从而可以检测蛋白质互作关系在细胞中的动态过程和互作的强弱程度。把原有载体上位于LacZ基因上的多克隆位点EcoRI-HindIII给消除掉了，将这些和新加的酶切位点分别分布于HA-MCS-YFPN173和Myc-MYC-YFPC155上，除了其它多个粘末端酶切点之外，在这个两个多克隆位点上分别布置了一个SmaI和PmlI平末端酶切点供作基因的通用插入或者重组插入。通过该载体，在HA-MCS-YFPN173和Myc-MYC-YFPC155两个不同多克隆位点区域(MCS1和MCS2)上同框插入两个不同目的基因，可以使用原生质体的瞬时转化表达，或者通过农杆菌介导转化植物叶片或者通过发根农杆菌诱导植物(如大豆子叶)发根，使两个融合蛋白同时表达，利用所得材料进行蛋白质Co-IP和BiFC分析，用来检测两个蛋白互作和功能分析，以及蛋白激酶对底物的磷酸化或泛素化连接酶对底物的泛素化研究等等。本专利技术成功利用所构建的质粒分析了两对基因之间的互作关系。1.水稻水孔蛋白OSPIP1；1和野生大豆蛋白激酶GsSnRK1之间的互作；2.野生大豆转录因子ERF71和野生大豆蛋白激酶GsSnRK1之间的互作。如图2所示，利用pPBEL-BiFC质粒和双分子荧光互补(BiFC)方法研究了野生大豆GsSnRK1与野生大豆转录因子GsERF71H在细胞核中的定位和互作；野生大豆GsSnRK1与水稻水孔蛋白OsPIP1；1在原生质膜定位上的互作和共定位。GsSnRK1同框(in-frame)插入位于Myc标签和YFPC155之间的SmaI位点，而GsERF71H和OsPIP1；1插入位于HA标签和YFPN173之间的PmlI位点。图2(A)和图2(B)两组图中的各小图说明(从左至右)：含有pPBEL-BiFC重组质粒的原生质体在白光下的影像；叶绿体自发光影像；黄色荧光蛋白(YFP)发光影像；白光和黄色荧光重叠影像。如图3所示，利用pPBEL-BiFC质粒和免疫共沉淀(Co-IP)方法研究野生大豆GsSnRK1与野生大豆转录因子GsERF71H(A)，野生大豆GsSnRK1与水稻水孔蛋白OsPIP1；1(B)之间的互作关系。图3(A)和图3(B)两组图中的各小图说明(从上排左至右和下排左至右)：总蛋白；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多功能植物双元质粒pPBEL‑BiFC的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.改造原有的多克隆位点，把原有的MCS区进行消除，引入两段新的MCS区，能有更多的酶切位点选择；步骤2.对原有的GFP进行消除，代替GFP和Hyg基因，引入YFP‑C155段和YFP‑N173段；步骤3.引入了HA和MYC标签，能进行western‑blot蛋白检测，使HA‑A蛋白‑YFP‑C155，MYC‑B蛋白‑YFP‑N173融合蛋白同时表达，通过检测A蛋白进行western‑blot分析，进而检测是否有B蛋白存在，反之亦然。

【技术特征摘要】
1.一种多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.改造原有的多克隆位点，把原有的MCS区进行消除，引入两段新的MCS区，能有更多的酶切位点选择；步骤2.对原有的GFP进行消除，代替GFP和Hyg基因，引入YFP-C155段和YFP-N173段；步骤3.引入了HA和MYC标签...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁晓东，宋雨，尤宏光，刘圆明，张航，李强，朱延明，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23