一种Cre/loxP基因删除系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及一种Cre/loxP基因删除系统及其应用。该系统包括植物表达载体I和II；植物表达载体I包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间依次插入有目标基因I的表达元件和NCre的表达元件；植物表达载体II包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间插入有CCre的表达元件。其能够使外源基因在转基因作物的营养生长阶段正常表达，能保持外源基因所带来的优良性状，转基因作物进入生殖生长阶段，发生对外源基因的删除，从而收获无外源基因的果实和种子，消除转基因安全隐患；其还具有高效性和简洁性。

A Cre/loxP gene deletion system and its application

The invention relates to the field of plant genetic engineering, in particular to a Cre/loxP gene deletion system and its application. The system comprises plant expression vectors I and II; plant expression vectors I comprise two co-directed loxP loci in which the expression elements of target gene I and NCre are inserted in turn; plant expression vectors II comprise two co-directed loxP loci in which CCre is inserted. Piece. It can make exogenous genes express normally in the vegetative growth stage of transgenic crops, and keep the good characters brought by exogenous genes. Transgenic crops enter the reproductive growth stage and delete exogenous genes, thus harvesting the fruits and seeds without exogenous genes, eliminating the hidden dangers of transgenic safety. Sex and simplicity.

【技术实现步骤摘要】
一种Cre/loxP基因删除系统及其应用
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及一种Cre/loxP基因删除系统及其应用。
技术介绍
随着生物技术的不断发展，转基因技术现已成为进行基因功能研究和植物遗传改良的重要工具(王根平等，2016)。植物基因工程技术，也被称为遗传转化技术，是指利用重组DNA技术在体外有目的的对外源或者内源基因进行改造和重新组合，借助生物、物理或化学手段将重组DNA插入到受体植物细胞的基因组中，实现重组基因在受体细胞内的稳定表达和遗传，从而达到赋予受体植物新性状的目的(黄珊等，2012)。随着转基因技术的不断发展与成熟，其已广泛应用于农作物的生产及改良中，且越来越多的转基因农作物已经向商品化发展(GriffithsAJFetal.,2005)。尽管人们对转基因作物的接受度越来越高，但事实上转基因植物的基因组上存在的选择标记基因(通常是抗生素基因或抗除草剂基因)仍然是监管机构和公众所关注的焦点，具有很大争议。这些争议多数是围绕转基因植物对食品安全和环境安全两方面的潜在影响展开的(YauYYetal.,2012)。因此，如何才能在利用好转基因技术的同时又能解决转基因植物的生物安全性问题，消除公众的忧虑，就成为了现如今亟待解决的问题。目前，已经报道的解决转基因安全问题的技术有很多种，根据其原理和目的大致可分为以下几类：防止基因逃逸的方法，安全标记基因法，基因定点修饰技术，标记基因删除技术。而在标记基因剔除法中，运用最多的就是Cre/LoxP系统。自1988年，Sauer等首次在小鼠细胞内利用Cre/loxP重组酶系统实现了loxP位点之间基因片段的删除(SauerBetal.,1987)后，Cre/loxP重组酶系统已经被广泛应用于生物科学领域，包括动物、植物和酵母。罗克明等建立了能高效且彻底删除外源基因的删除系统“Gene-deletor”，但是该系统的局限在于其不能用于杂交体系。为了能将该系统运用于杂交作物当中，将重组酶进行拆分成为解决这个问题的主要办法。葛佳等根据Cre重组酶的结构，选取了五个拆分位点，并且都用内含肽Intein介导，通过比较拆分后的重组活性选出了最佳的拆分位点。将拆分后的无活性的Cre重组酶片段分别构建到两个载体中，通过农杆菌介导的植物转化得到转基因拟南芥，并进行杂交实验，证实了在866位点拆分重组酶Cre，并通过Intein介导拆分后的片段在拟南芥杂交系统中可恢复重组活性，但杂交后的拟南芥种子中仍存在外源基因。
技术实现思路
为解决上述问题本专利技术提供一种Cre/loxP基因删除系统，该系统能够高效删除杂交作物种子中的外源基因。一种Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，包括植物表达载体I和II；植物表达载体I包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间依次插入有目标基因I的表达元件和NCre的表达元件，所述NCre的基因序列如SEQIDNo.1所示；植物表达载体II包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间插入有CCre的表达元件，所述CCre的基因序列如SEQIDNo.2所示。进一步的，上述植物表达载体II的两个同向loxP位点间还插入有目标基因II的表达元件，该表达元件位于CCre表达元件之前。进一步的，所述NCre的表达元件包括启动子、NCre基因、内含肽基因In和终止子，所述启动子为花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子，所述内含肽基因In的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。进一步的，所述CCre的表达元件包括启动子、内含肽基因IC、CCre基因和终止子，所述启动子为花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子，其与控制NCre的启动子不具有同种特异性，所述内含肽基因IC的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。进一步的，所述花粉特异性启动子是指proACA9或proDLL，所述胚珠特异性启动子是指proDD45，proACA9的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，proDLL的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，proDD45的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示.进一步的，所述目标基因是抗生物胁迫、抗非生物基因、提高农作物产量或改善农作物品质的目标基因。进一步的，所述目标基因I和II的表达元件包括，启动子、目标基因和终止子，所述启动子为CaMV35S，其核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。进一步的，所述NCre表达元件的启动子和NCre基因间依次插入有连接肽基因和报告基因，所述CCre表达元件的启动子和CCre基因间依次插入有连接肽基因和报告基因，连接肽为LP4/2A，报告基因为GFP或GUS，所述连接肽基因的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。上述Cre/LoxP基因删除系统在生产无外源基因的果实或种子中的应用也是本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种利用上述Cre/loxP基因删除系统生产无外源基因的果实或种子的制备方法，包括以下步骤：(1)构建上述的植物表达载体I和II；(2)将植物表达载体I导入植物基因组，制备转基因植物I；(3)将植物表达载体II导入植物基因组，制备转基因植物II；(4)将转基因植物I和II作为亲本互相杂交，获得无外源基因的果实或种子。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的基因删除系统能够彻底删除两个同向的loxP位点之间的目标基因表达元件、特异性启动子、重组酶基因、内含肽和终止子等所有外源基因，获得无任何外源基因的种子或果实。1.该删除系统能够使外源基因在转基因作物的营养生长阶段正常表达，因而能保持外源基因所带来的优良性状，在转基因作物进入生殖生长阶段后，即发生对外源基因的删除，从而收获无外源基因的果实和种子，消除转基因安全隐患；2.该删除系统具有高效性和简洁性，即只需要单一的重组酶Cre和较短的重组酶结合序列(loxP)就能发挥其功能。附图说明图1是特异性启动子proACA9、proDLL、proDD45控制的Cre/loxP基因删除系统的植物表达载体构建示意图；图2是转基因单拷贝纯合拟南芥植株启动子特异性检测，其中，A：转pCCre:nls-ACA9株系启动子特异性检测；B：转pCCre:nls-DLL株系启动子特异性检测；C：转pNCre:nls-DD45株系启动子特异性验证；图3是转基因单拷贝纯合拟南芥植株的表达量检测，其中，A：转pCCre:nls-ACA9株系CCre基因表达量检测；B：转pCCre:nls-DLL株系CCre基因表达量检测；C：转pNCre:nls-DD45株系NCre基因表达量检测；图4是转基因拟南芥pCCre:nls-ACA9与pNCre:nls-DD45杂交F2代植株NCre、CCre、BAR、NPTII基因表达量检测；图5是转基因拟南芥pCCre:nls-DLL与pNCre:nls-DD45杂交F2代植株NCre、CCre、BAR、NPTII基因表达量检测；图6：各杂交组合F2代植株花粉GUS组织化学染色及删除效率统计，其中，A：pCCre:nls-ACA9与pNCre:nls-DD45杂交F2代植株及pCCre:nls-DLL与pNCre:nls-DD45杂交F2代植株花粉GUS组织化学染色；B：各杂交组合F2代植株花粉的GUS酶活定量测定及删除效率的统计。具体实施方式以下结合实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，包括植物表达载体I和II；植物表达载体I包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间依次插入有目标基因I的表达元件和NCre的表达元件，所述NCre的基因序列如SEQ ID No.1所示；植物表达载体II包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间插入有CCre的表达元件，所述CCre的基因序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，包括植物表达载体I和II；植物表达载体I包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间依次插入有目标基因I的表达元件和NCre的表达元件，所述NCre的基因序列如SEQIDNo.1所示；植物表达载体II包括两个同向的loxP位点，所述的同向loxP位点间插入有CCre的表达元件，所述CCre的基因序列如SEQIDNo.2所示。2.一种如权利要求1所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，植物表达载体II的两个同向LoxP位点间还插入有目标基因II的表达元件，该表达元件位于CCre表达元件之前。3.一种如权利要求2所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，所述NCre的表达元件包括启动子、NCre基因、内含肽基因In和终止子，所述启动子为花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子，所述内含肽基因In的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。4.一种如权利要求3所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，所述CCre的表达元件包括启动子、内含肽基因IC、CCre基因和终止子，所述启动子为花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子，其与控制NCre基因的启动子不具有同种特异性，所述内含肽基因IC的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。5.一种如权利要求4所述的Cre/loxP基因删除系统，其特征在于，所述花粉特异性启动子是指proACA9或proDLL，所述胚珠特异性启动子是指proDD45，...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗克明，杨晨，葛佳，窦立雯，汪丽君，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50