一种水稻遗传转化方法技术

本发明专利技术属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种水稻遗传转化方法，包括如下步骤：愈伤诱导、制备侵染液、侵染、共培养、脱菌‑筛选、分化、生根培养，得到水稻的带有Kan抗性基因的水稻遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的水稻转基因植株。

A genetic transformation method for rice

The present invention belongs to the field of plant genetic transformation technology, especially a method of genetic transformation of rice, including the following steps: callus induction, preparation of infected liquid, infection, co culture, screening, differentiation and rooting of the rice. The rice genetic transformation plant with Kan resistance gene is obtained. The method is simple, easy to operate, parameters and medium optimization, and can obtain transgenic rice plants with high genetic transformation in a relatively short time.

【技术实现步骤摘要】
一种水稻遗传转化方法
本专利技术属于植物遗传转化
，特别提供了一种水稻遗传转化方法。
技术介绍
水稻是世界上分布最广、最为重要的粮食作物之一，其遗传转化一直受到大家的重视。传统水稻的品种改良方法一般是通过品种杂交、远缘杂交等，其转基因技术起源于1988年，到目前为止，其遗传转化体系已经发展的较为完善。但是，仍然存在着转化时间长、转化效率低等问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种水稻遗传转化方法，通过调整过程中的培养基及培养参数，大大缩短了水稻遗传转化的时间，并且提高了遗传转化率。本专利技术是这样实现的，一种水稻遗传转化方法，包括如下步骤：1)愈伤诱导水稻种子的灭菌：用75％的乙醇灭菌5min，再用25％NaClO，加1滴吐温，于摇床200rpm，震荡处理40min；使用无菌水清洗3-5次，用灭菌滤纸吸干表面水分；愈伤诱导：将灭菌后的种子，放到Os1培养基上，31℃培养室中16h光照/8h黑暗培养8-10天；定期查看愈伤生长状态，有无长菌情况，待愈伤组织长至约与种子大小一致、呈金黄色时，即可用于侵染；2)制备侵染液取50mlOs-inf，加入100μlAS，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；3)侵染将调好的侵染液加至水稻愈伤中，放置摇床100rpm侵染30min，取出用无菌滤纸吸干；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的愈伤组织接至Os-cocu培养基，暗处培养3天，至每个侵染后的愈伤组织周围农杆菌长势良好，证明侵染成功；5)脱菌-筛选脱菌：200ml无菌水加cef400微升，终浓度500mg/L，分5次清洗愈伤：第1-2次，轻摇清洗后弃去废液；第3次摇床100rpm，震荡清洗90min；第4-5次，轻摇清洗后弃去废液，最后，用无菌滤纸吸干愈伤；筛选：将吸干的愈伤，接至Os-Hn筛选培养基，每隔10天继代1次，继代至第3-4次时，外植体周围出现新生长的金黄色愈伤，为筛选成功的愈伤；6)分化将筛选出的阳性愈伤接至Os2-Hn分化培养基，每隔10-15d进行一次继代，继代3-4次，期间：分化开始15d，愈伤开始出现绿色；最终分化成功的愈伤再经25-30d成3-5cm幼苗；7)生根将长至3-5cm的阳性幼苗清理好基部愈伤，接种至Os3培养基8-12天，至长出1-2条新生根；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：进一步地，所述愈伤诱导过程中，Os1培养基上每皿接种18粒种子。进一步地，所述步骤2)中制备的侵染液OD600＝1.0。进一步地，选用的农杆菌为EHA105，载体骨架为Pcambia1300，携带的为Kan抗性基因。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的水稻转基因植株。附图说明图1为利用本专利技术的方法得到的愈伤诱导阶段的水稻愈伤；图2为利用本专利技术的方法得到的筛选阶段继代一次的阳性愈伤；图3为利用本专利技术的方法得到的筛选阶段继代两次的阳性愈伤；图4为利用本专利技术的方法得到的筛选阶段继代三次的阳性愈伤；图5为利用本专利技术的方法得到的分化阶段的阳性苗；图6为利用本专利技术的方法得到的生根阶段的阳性苗。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例、一种水稻遗传转化方法，包括如下步骤：1)愈伤诱导水稻种子的灭菌：取水稻种子100粒(稻花香2号)，用75％的乙醇灭菌5min，再用25％NaClO，加1滴吐温，于摇床200rpm，震荡处理40min；使用无菌水清洗3-5次，用灭菌滤纸吸干表面水分；愈伤诱导：将灭菌后的种子，放到Os1培养基上，每皿接种18粒种子，31℃培养室中16h光照8h黑暗培养8-10天；定期查看愈伤生长状态，有无长菌情况，待愈伤组织长至约与种子大小一致、呈金黄色时，即可用于侵染，约成功诱导出50个种子愈伤，参考图1；2)制备侵染液取50mlOs-inf，加入100μlAS，将农杆菌(EHA105，载体骨架为Pcambia1300，携带的为Kan抗性基因)挑至混合液中，制成侵染液，OD600＝1.0；3)侵染将调好的侵染液加至水稻愈伤中，放置摇床100rpm侵染30min，取出用无菌滤纸吸干；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的愈伤组织接至Os-cocu培养基，暗处培养3天，至每个侵染后的愈伤组织周围农杆菌长势良好，证明侵染成功；5)脱菌-筛选脱菌：200ml无菌水加cef400微升，终浓度500mg/L，分5次清洗愈伤：第1-2次，轻摇清洗后弃去废液；第3次摇床100rpm，震荡清洗90min；第4-5次，轻摇清洗后弃去废液，最后，用无菌滤纸吸干愈伤；筛选：将吸干的愈伤，接至Os-Hn筛选培养基，每隔10天继代1次，继代至第3-4次时，外植体周围出现新生长的金黄色愈伤，为筛选成功的愈伤，参考图2、图3和图4；6)分化将筛选出的阳性愈伤接至Os2-Hn分化培养基，每隔10-15d进行一次继代，继代3-4次，期间：分化开始15d，愈伤开始出现绿色；最终分化成功的愈伤再经25-30d成3-5cm幼苗，参考图5；7)生根将长至3-5cm的阳性幼苗清理好基部愈伤，接种至Os3培养基8-12天，至长出1-2条新生根，参考图6；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)愈伤诱导水稻种子的灭菌：用75％的乙醇灭菌5min，再用25％NaClO，加1滴吐温，于摇床200rpm，震荡处理40min；使用无菌水清洗3‑5次，用灭菌滤纸吸干表面水分；愈伤诱导：将灭菌后的种子，放到Os1培养基上，31℃培养室中16h光照/8h黑暗培养8‑10天；定期查看愈伤生长状态，有无长菌情况，待愈伤组织长至约与种子大小一致、呈金黄色时，即可用于侵染；2)制备侵染液取50ml Os‑inf，加入100μl AS，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；3)侵染将调好的侵染液加至水稻愈伤中，放置摇床100rpm侵染30min，取出用无菌滤纸吸干；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的愈伤组织接至Os‑cocu培养基，暗处培养3天，至每个侵染后的愈伤组织周围农杆菌长势良好，证明侵染成功；5)脱菌‑筛选脱菌：200ml无菌水加cef 400微升，终浓度500mg/L，分5次清洗愈伤：第1‑2次，轻摇清洗后弃去废液；第3次摇床100rpm，震荡清洗90min；第4‑5次，轻摇清洗后弃去废液，最后，用无菌滤纸吸干愈伤；筛选：将吸干的愈伤，接至Os‑Hn筛选培养基，每隔10天继代1次，继代至第3‑4次时，外植体周围出现新生长的金黄色愈伤，为筛选成功的愈伤；6)分化将筛选出的阳性愈伤接至Os2‑Hn分化培养基，每隔10‑15d进行一次继代，继代3‑4次，期间：分化开始15d，愈伤开始出现绿色；最终分化成功的愈伤再经25‑30d成3‑5cm幼苗；7)生根将长至3‑5cm的阳性幼苗清理好基部愈伤，接种至Os3培养基8‑12天，至长出1‑2条新生根；各步骤中用到的培养基具体配方见下表：...

【技术特征摘要】
1.一种水稻遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)愈伤诱导水稻种子的灭菌：用75％的乙醇灭菌5min，再用25％NaClO，加1滴吐温，于摇床200rpm，震荡处理40min；使用无菌水清洗3-5次，用灭菌滤纸吸干表面水分；愈伤诱导：将灭菌后的种子，放到Os1培养基上，31℃培养室中16h光照/8h黑暗培养8-10天；定期查看愈伤生长状态，有无长菌情况，待愈伤组织长至约与种子大小一致、呈金黄色时，即可用于侵染；2)制备侵染液取50mlOs-inf，加入100μlAS，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；3)侵染将调好的侵染液加至水稻愈伤中，放置摇床100rpm侵染30min，取出用无菌滤纸吸干；4)共培养将步骤3)吹至表面无液体的愈伤组织接至Os-cocu培养基，暗处培养3天，至每个侵染后的愈伤组织周围农杆菌长势良好，证明侵染成功；5)脱菌-筛选脱菌：200ml无菌水加cef400微升，终浓度500mg/L，分5次清洗愈伤：第1-2次，轻摇清洗后弃去废液；第3次摇床100rpm，震荡清洗90m...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘寒冬，
申请(专利权)人：刘寒冬，
类型：发明
国别省市：辽宁,21