一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用。一种重组表达载体，其特征在于含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1；所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1，水稻基因OsNAR2.1核苷酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术所述的重组表达载体在减少水稻田甲烷排放中的应用。本发明专利技术首次报道，表达水稻基因OsNAR2.1基因启动子启动基因OsNAR2.1能减少水稻根际土壤产甲烷菌含量，增加甲烷氧化菌含量，降低稻田甲烷的排放方面的应用。

A recombinant expression vector containing rice gene OsNAR2.1 and its promoter and its application

The invention discloses a recombinant expression vector containing rice gene OsNAR2.1 and its promoter and its application. A recombinant expression vector is characterized by the promoter of rice gene OsNAR2.1 and the rice gene OsNAR2.1, and the promoter nucleotide sequence of the rice gene OsNAR2.1 is SEQ ID NO.1, and the rice gene OsNAR2.1 nucleotide sequence is SEQ ID NO.2. The recombinant expression vector of the invention is applied to reduce methane emission from paddy fields. It is the first time to report that the expression of the promoter gene OsNAR2.1 of the rice gene OsNAR2.1 gene promoter can reduce the content of methanogenic bacteria in the rhizosphere soil of rice, increase the content of methane oxidizing bacteria and reduce the application of methane emission in rice fields.

【技术实现步骤摘要】
一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用。
技术介绍
甲烷(CH4)是全球主要的温室气体之一，在全球变暖温室效应中的能力比二氧化碳高出25倍。此外，CH4还影响大气的化学和氧化能力(IPCC.Changesinatmosphericconstituentsandinradiativeforcing.Pp.2.9.2–2.9.3inS.Solomon,D.Qin,andM.Manning,etal.eds.Climatechange2007:thephysicalsciencebasis.ContributionofWorkingGroupItotheFourthAssessmentReportoftheIntergovernmentalPanelonClimateChange.2007.CambridgeUniv.Press,Cambridge,U.K.)。稻田是大气CH4的主要排放源之一，占总排放量的5％～19％。我国水稻种植面积占全球水稻种植面积的23％，为保障农业生产产量，我国水稻田大量使用氮肥，造成温室气体的排放增加，影响了一系列环境生态效应(FrolkingS,QiuJJ,BolesS,etal.CombiningremotesensingandgroundcensusdatatodevelopnewmapsofthedistributionofriceagricultureinChina.GlobalBiogeochemicalCycles.2002.16(4):38-1–38-10.)。有研究表明，稻田施尿素可以增加CH4的排放(HuRG，HatanoR，KusaK，etal.EffectofnitrogenfertilizationonmethanefluxinastructuredclaysoilcultivatedwithonioninCentralHokkaido,Japan.SoilScience&PlantNutrition,2002,48(6):797-804)。尿素的施加能改变水稻根系微生物的丰度(XFan,HYu,QWu,JMa,HXu.etal.Effectsoffertilizationonmicrobialabundanceandemissionsofgreenhousegases(CH4andN2O)inricepaddyfields.EcologyandEvolution,2016,6(4):1054)稻田土壤中甲烷产生的唯一生物产生源是产甲烷菌。产甲烷菌的mcrA基因控制CH4产生的最后一步，甲烷氧化菌的pmoA基因则是编码利用CH4的第一个关键酶，将CH4氧化为甲醇。表达水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsNAR2.1能够显著增加水稻田土壤甲烷氧化菌pmoA基因的表达丰度，减少产甲烷菌mcrA基因的表达丰度，从而降低水稻田甲烷的排放。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体。本专利技术的另一目的是提供该重组表达载体的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种重组表达载体，其特征在于含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1；所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列为SEQIDNO.1，水稻基因OsNAR2.1核苷酸序列为SEQIDNO.2。作为本专利技术的一种优选实施方式，所述的重组表达载体的出发载体为pTCK303载体。作为本专利技术的一种优选实施方式，所述的重组表达载体中所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1通过相应酶切位点连接形成pOsNAR.1:OsNAR2.1重组片段导入到出发载体中。本专利技术所述的重组表达载体在减少水稻田甲烷排放中的应用；优选在减少水稻根际土壤产甲烷菌含量，增加甲烷氧化菌含量，降低稻田甲烷的排放方面的应用。有益效果：1、通过系统研究，首次提供了水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsNAR2.1的生物学功能，可以增加水稻田土壤甲烷氧化菌pmoA基因的表达丰度，降低产甲烷菌mcrA基因的表达丰度(图1)。2、本专利技术人首次提供水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsNAR2.1的转基因植株，在水稻田表现出显著降低水稻田甲烷的排放产量33％～90％(图3-5)。附图说明图1：水稻基因OsNAR2.1启动子启动OsNAR2.1载体示意图。图2：水稻根际土甲烷菌拷贝数分析。a：产甲烷菌(mcrA)含量。b：甲烷氧化菌(pmoA)含量。图3：不同时间稻田甲烷排放量分析图4:不同时间稻田甲烷排放量分析图5:不同时间稻田甲烷排放量分析具体实施方案一、水稻基因OsNAR2.1启动子序列的克隆1)水稻基因组DNA的提取水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，称取0.1g左右叶片，用液氮研碎，研磨充分加入2ml离心管，迅速加入1mlDNA提取液(购自TIANGEN,中国)，充分摇匀振荡后，抽提水稻基因组DNA。2)OsNAR2.1基因全长的克隆通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到水稻的NAR2.1(AP004023.2)基因的启动子，用软件Primer5.0设计引物序列(如下)，从水稻基因组DNA中扩增NAR2.1基因的启动子序列。P1:5’-TGCTGACAAACCAAACCGACT-3’(SEQIDNO.3)P2:5’-CCCCACCTCTCCCACCTCAC-3’(SEQIDNO.4)以步骤1)获得的水稻基因组DNA为模板，用高保真酶(PrimeStarHSDNApolymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体(购自Takara公司)，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻基因OsNAR2.1的启动子序列(SEQIDNO.1)。二、水稻基因OsNAR2.1序列的克隆1)总RNA的提取水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，用0.2mM硝态氮进行处理6小时后立即取根迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右根，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1mlTrizol试剂(购自Invitrogen,USA)，充分摇匀振荡后，抽提总RNA。2)OsNAR2.1基因全长的克隆利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到水稻的NAR2.1基因系列OsNAR2.1(AP004023.2)。设计引物(如下)从组织cDNA库中钓出OsNAR2.1的全长序列。P3:5’-CAATGGCGAGGCTAGCCGGCGTT-3’(seqidno.5)p4:5’-CGATCTACTTGTCCTTCTTGCGCTTCT-3’(SEQIDNO.6)以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶(PrimeStarHSDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组表达载体，其特征在于含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1；所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1，水稻基因OsNAR2.1核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，其特征在于含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1；所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列为SEQIDNO.1，水稻基因OsNAR2.1核苷酸序列为SEQIDNO.2。2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体的出发载体为pTCK303载体。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：范晓荣，陈景光，刘书华，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32