本发明专利技术涉及一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，其工艺步骤包括：通过体细胞胚发生技术体系诱导胚性愈伤组织；抗生素潮霉素和硫酸卡那霉素适宜浓度的筛选；农杆菌侵染液的制备；侵染和共培养；抗性愈伤组织的筛选和继代培养；抗性体细胞胚的萌发与成苗；转基因植株的GUS组织学染色和PCR检测。本发明专利技术以百合的胚性愈伤组织为受体材料，首次在遗传转化后诱导产生体细胞胚进而直接发育形成完整植株，转化效率比其他种类百合现有的报道显著提高，可达29.17%。其优势在于受体细胞基数大，转化后诱导的体细胞胚是单细胞起源，很好地避免嵌合体的产生，且转化后代外源基因遗传稳定性高，变异率低。
A highly efficient genetic transformation system based on somatic embryogenesis in Lilium tenuifolia
The present invention relates to a high efficient genetic transformation system of Lilium Lilium based on somatic embryogenesis. Its process steps include: inducing embryogenic callus through somatic embryogenesis technology system; screening suitable concentration of antibiotic hygromycin and kanamycin sulfate; preparation of Agrobacterium tumefaciens Infection fluid; infection and co culture; resistance to resistance. Screening and subculture of injured tissues; Germination and plantlet formation of resistant somatic embryos; GUS histochemical staining and PCR detection of transgenic plants. The present invention takes the embryogenic callus of lily as the receptor material. It is the first time to induce somatic embryos to develop into a complete plant after genetic transformation, and the conversion efficiency is significantly higher than that of other kinds of Lilium, up to 29.17%. The advantage lies in the large number of receptor cells. The induced somatic embryo is a single cell origin, which can avoid the production of chimeras well, and the genetic stability of the transgene is high and the mutation rate is low.
【技术实现步骤摘要】
一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系
本专利技术属于球根花卉生物
，具体涉及百合稳定遗传转化体系的建立，即以诱导出的胚性愈伤组织为受体，基于农杆菌介导法针对细叶百合建立一种稳定高效的遗传转化体系。
技术介绍
植物遗传转化(plantgenetictransformation)，是一种独特的DNA跨界转移技术，是有针对性的将外源基因导入植物基因组中，让其在后代植株中遗传和稳定表达的植物遗传改良技术。这项技术是植物基因工程的核心，转基因技术的建立和发展，使人们能够根据需求将特定的基因导入不同植物之间进行表达，为植物遗传改良提供了新途径。百合(Lilium)是重要的球根花卉,花色丰富，株型优美，观赏价值高、市场需求量大、经济价值可观。我国具有丰富的野生百合资源，但目前国内生产中应用的百合种球大多依赖进口，我国具有自主知识产权的品种极少，种球生产技术体系亦不成熟，生产成本居高不下。伴随生物技术的快速发展,建立稳定高效的遗传转化体系对百合种质资源保存、种球繁育以及通过基因工程技术进行遗传性状改良具有重要意义。在百合遗传转化研究中，利用基因枪法已成功获得了一些转基因百合，但基因枪法转化效率低、形成的嵌合体多，且筛选量工作量大、成本高，转化效率较低。目前应用最广的转基因方法是农杆菌介导法，具有转化成本低，转化效率高的优点，但农杆菌介导法成功应用于百合遗传转化的案例尚少，这可能是由于百合对农杆菌的侵染不敏感、且基因型差异较大的缘故。Cohen(1992)首次用农杆菌介导法转化百合'NellieWhite'鳞片，在鳞片上观察到瘤状突起，并且在诱导产生的愈伤组织里检测出冠瘿碱基因的表达。Hoshi(2004)等以东方百合花丝诱导产生的愈伤组织为受体，获得了6株携带目的基因的转化苗，转化效率为3%。WangYue(2012)等以农杆菌菌株AGL0对20个百合品种花丝及花梗诱导产生的愈伤组织进行侵染，GUS瞬时表达率从0.3%-20.6%，但是稳定表达率仅为1.4%。YinyanQi(2014)等分别以OT百合‘罗宾娜’（Liliumtenuifoliumoriental×trumpet）的悬浮细胞团作为转化受体材料进行了农杆菌介导的遗传转化，从132株抗性植株中检测获得4个转基因株系。由此可见，关于农杆菌介导百合遗传转化的研究尚少，且转化效率低、遗传稳定性差、转化后受体材料再生困难，仍然无法适用于百合生产和分子育种的需求。利用体细胞胚发生建立百合遗传转化体系的研究尚未见报道。细叶百合(LiliumpumilumDC.Fisch.)，别名山丹，是我国原产的珍稀野生百合。细叶百合抗性较强，耐旱、耐寒、耐盐碱，引种无须驯化，加之花色艳丽、花型优美，可直接应用于家庭盆栽、庭院及城市园林绿化。然而，细叶百合植株茎秆细弱、花朵娇小、颜色单一，观赏性状有待于进一步改良。高效遗传转化体系的建立对于种质资源保存、基因工程育种以及百合发育、繁殖等领域的基因功能验证具有重要意义。当前对细叶百合的研究大多集中在分类学、生物学、无性繁殖技术等方面，陈丽静等(2013)曾以鳞片为外植体初步探讨了细叶百合的组织培养技术，关于细叶百合的遗传转化尚未见报道。因此，建立稳定、高效的细叶百合遗传转化体系迫在眉睫。体细胞胚是一种由单细胞发育而成的胚状体，体细胞胚发生作为一种典型的植物再生方式具有取材少、遗传稳定性高、变异率低和再生率高等优点，因此基于体细胞胚发生过程建立遗传转化体系可有效减轻转基因植株后期繁重的筛选工作，而且，利用单细胞起源的体胚发生过程以初始的胚性愈伤组织为转化受体进行遗传转化能够很好地避免嵌合体的产生。另外，与其它外植体相比，胚性细胞更有利于T-DNA的摄入和整合，因而更适宜作高效的转化受体。本专利技术以细叶百合的胚性愈伤组织为受体材料，建立基于农杆菌介导法的细叶百合遗传转化技术体系。对常用抗生素潮霉素和卡那霉素进行亚致死浓度筛选，研究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间及共培养方式对转化效率的影响，以期建立高效稳定的细叶百合遗传转化体系，从而为细叶百合基于转基因技术的相关研究奠定基础。
技术实现思路
为弥补现有技术的不足，本专利技术的目的是提出一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，采用细叶百合高效体细胞胚发生体系诱导出胚性愈伤组织，以胚性愈伤组织为转化受体材料，对胚性愈伤组织最适抗生素浓度、农杆菌侵染过程中最适预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间及共培养方式进行了研究，建立了高效稳定的细叶百合遗传转化技术体系。本专利技术提供的技术方案，具体步骤如下：1.获得胚性愈伤组织选取小鳞茎直径为1-1.2cm的细叶百合无菌苗，将鳞片切为0.5cm2小块，凹面向上、平铺接种于体胚诱导培养基[MS+1.0mg·L-1Picloram(毒莠定)+0.2mg·L-1NAA(萘乙酸)]中。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，持续黑暗培养；接种6周时，形成亮黄色，颗粒性明显的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接至MS培养基中进行胚性细胞增殖，增殖4周时，筛选出长势好而快，没有褐化且质地致密的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中预培养15d，作为转化的受体材料。2.抗生素敏感性测定通过在体细胞胚诱导培养基[MS+1.0mg·L-1Picloram(毒莠定)+0.2mg·L-1NAA(萘乙酸)]中添加不同浓度梯度的抗生素，测定硫酸卡那霉素和潮霉素对于细叶百合胚性愈伤组织的亚致死浓度，确立硫酸卡那霉素和潮霉素的抗性筛选使用浓度分别为100mg·L-1和30mg·L-1。3.优化遗传转化条件比较转化过程中不同转化条件转化后的GUS瞬时表达率和抗性筛选2个月后的抗性愈伤发生率，确定转化条件如下：受体材料预培养15d，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间10min，固体共培养48h。4.制备农杆菌侵染液将携带目标基因的载体转入农杆菌EHA105中，利用载体相应的抗生素筛选和菌落PCR鉴定出阳性的转化子；挑取阳性的转化子克隆，接种于含相应抗生素的5mL新鲜YEB液体培养基中200rpm振荡培养至菌液较浓，吸取菌液按1：50的比例转接到50ml液体YEB培养基，继续培养至OD600为0.6，5000rpm离心10min，收集菌体；用50mL含有100μM乙酰丁香酮(AS)的MS液体培养基重悬菌体，将重悬液继续200rpm振荡培养2h，作为农杆菌侵染液备用。5.侵染和共培养在超净工作台内，将生长状态良好的细叶百合胚性愈伤组织块浸没于农杆菌侵染液中10min，期间不断轻轻摇晃以便使组织块与侵染液充分接触；从侵染液中取出组织块后，用无菌滤纸充分吸干组织块表面的残留菌液，再转移至共培养培养基[MS+1.0mg·L-1Picloram(毒莠定)+0.2mg·L-1NAA(萘乙酸)+100μMAS(乙酰丁香酮)]中，25±1℃进行持续黑暗培养48h。6.抗性愈伤组织的筛选与继代培养将共培养后的愈伤组织转接于脱菌培养基[MS+1.0mg·L-1Picloram(毒莠定)+0.2mg·L-1NAA(萘乙酸)+400mg·L-1cef(头孢霉素)+30mg·L-1Hyg(潮霉素)]，于25±1℃暗培养条件下进行脱菌培养和筛选培养，2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，其特征在于：包括以下步骤：（1）获得胚性愈伤组织选取小鳞茎直径为1‑1.2 cm的细叶百合无菌苗，将鳞片切为0.5 cm2小块，凹面向上、平铺接种于体胚诱导培养基 [MS + 1.0 mg·L‑1 Picloram （毒莠定）+ 0.2 mg·L‑1 NAA （萘乙酸）] 中，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，持续黑暗培养；接种6周时，形成亮黄色，颗粒性明显的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接至MS培养基中进行胚性细胞增殖，增殖4周时，筛选出长势好而快，没有褐化且质地致密的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中预培养15 d，作为转化的受体材料；（2）抗生素敏感性测定通过在体细胞胚诱导培养基 [MS + 1.0 mg·L‑1Picloram（毒莠定）+ 0.2 mg·L‑1 NAA（萘乙酸）] 中添加不同浓度梯度的抗生素，测定硫酸卡那霉素和潮霉素对于细叶百合胚性愈伤组织的亚致死浓度，确立硫酸卡那霉素和潮霉素的抗性筛选使用浓度分别为100 mg·L‑1和30 mg·L‑1；（3）优化遗传转化条件比较转化过程中不同转化条件转化后的GUS瞬时表达率和抗性筛选2个月后的抗性愈伤发生率，确定转化条件如下：受体材料预培养15 d，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间10min，固体共培养48h；（4）制备农杆菌侵染液将携带目标基因的载体转入农杆菌EHA105中，利用载体相应的抗生素筛选和菌落PCR鉴定出阳性的转化子；挑取阳性的转化子克隆，接种于含相应抗生素的5 mL新鲜YEB液体培养基中200 rpm振荡培养至菌液较浓，吸取菌液按1：50的比例转接到50 ml液体YEB培养基，继续培养至OD600为0.6，5000 rpm离心10 min，收集菌体；用50 mL含有100 μM 乙酰丁香酮 (AS) 的MS液体培养基重悬菌体，将重悬液继续200 rpm振荡培养2 h，作为农杆菌侵染液备用；（5）侵染和共培养在超净工作台内，将生长状态良好的细叶百合胚性愈伤组织块浸没于农杆菌侵染液中10 min，期间不断轻轻摇晃以便使组织块与侵染液充分接触；从侵染液中取出组织块后，用无菌滤纸充分吸干组织块表面的残留菌液，再转移至共培养培养基[MS + 1.0 mg·L‑1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L‑1 NAA (萘乙酸) +100 μM AS (乙酰丁香酮) ]中，25±1℃进行持续黑暗培养48 h；（6）抗性愈伤组织的筛选与继代培养将共培养后的愈伤组织转接于脱菌培养基 [MS + 1.0 mg·L‑1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L‑1 NAA (萘乙酸) + 400 mg·L‑1 cef (头孢霉素)+ 30 mg·L‑1 Hyg (潮霉素) ]，于25±1℃暗培养条件下进行脱菌培养和筛选培养，2周后将完全脱菌的愈伤组织转接至抗性愈伤筛选培养基 [MS + 1.0 mg·L‑1Picloram (毒莠定) + 0.2 mg·L‑1 NAA (萘乙酸) + 30 mg·L‑1 Hyg(潮霉素) ] 中继续培养，此后每2周转接一次，培养4周抗性愈伤组织上会新生出体细胞胚；（7）体细胞胚萌发和成苗筛选培养结束后，切除愈伤基部坏死的组织，将长出体细胞胚的胚性培养物转于体胚萌发培养基 [MS + 0.5 mg·L‑16‑BA(6‑苄氨基腺嘌呤)] 上，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80‑90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m‑2·s‑1；培养4周可形成具有子叶和根的成熟体细胞胚，将成熟体细胞胚转接至MS基本培养基中进行培养，2周后发育形成完整的转化植株；（8）转化植株的转基因鉴定a. GUS组织学染色：对转化植株的叶片、鳞片、根分别进行常规GUS组织染色，以未转化的野生型植株作为对照，如果成功染色说明携带标记基因的载体成功整合到植株基因组中；b. PCR检测：对成功染色的植株提取基因组DNA，针对载体T‑DNA区域内的DNA序列设计特异引物，以细叶百合基因组DNA为模板进行PCR扩增，以野生型植株作对照，若转化植株的PCR结果为阳性，则表明外源基因整合到了植株的基因组中。...
【技术特征摘要】
1.一种基于体细胞胚发生的细叶百合高效遗传转化体系，其特征在于：包括以下步骤：（1）获得胚性愈伤组织选取小鳞茎直径为1-1.2cm的细叶百合无菌苗，将鳞片切为0.5cm2小块，凹面向上、平铺接种于体胚诱导培养基[MS+1.0mg·L-1Picloram（毒莠定）+0.2mg·L-1NAA（萘乙酸）]中，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，持续黑暗培养；接种6周时，形成亮黄色，颗粒性明显的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接至MS培养基中进行胚性细胞增殖，增殖4周时，筛选出长势好而快，没有褐化且质地致密的胚性愈伤组织转入体胚诱导培养基中预培养15d，作为转化的受体材料；（2）抗生素敏感性测定通过在体细胞胚诱导培养基[MS+1.0mg·L-1Picloram（毒莠定）+0.2mg·L-1NAA（萘乙酸）]中添加不同浓度梯度的抗生素，测定硫酸卡那霉素和潮霉素对于细叶百合胚性愈伤组织的亚致死浓度，确立硫酸卡那霉素和潮霉素的抗性筛选使用浓度分别为100mg·L-1和30mg·L-1；（3）优化遗传转化条件比较转化过程中不同转化条件转化后的GUS瞬时表达率和抗性筛选2个月后的抗性愈伤发生率，确定转化条件如下：受体材料预培养15d，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间10min，固体共培养48h；（4）制备农杆菌侵染液将携带目标基因的载体转入农杆菌EHA105中，利用载体相应的抗生素筛选和菌落PCR鉴定出阳性的转化子；挑取阳性的转化子克隆，接种于含相应抗生素的5mL新鲜YEB液体培养基中200rpm振荡培养至菌液较浓，吸取菌液按1：50的比例转接到50ml液体YEB培养基，继续培养至OD600为0.6，5000rpm离心10min，收集菌体；用50mL含有100μM乙酰丁香酮(AS)的MS液体培养基重悬菌体，将重悬液继续200rpm振荡培养2h，作为农杆菌侵染液备用；（5）侵染和共培养在超净工作台内，将生长状态良好的细叶百合胚性愈伤组织块浸没于农杆菌侵染液中10min，期间不断轻轻摇晃以便使组织块与侵染液充分接触；从侵染液中取出组织块后，用无菌滤纸充分吸干组织块表面的残留菌液，再转移至共培养培养基[MS+1.0mg·L-1Picloram(毒莠定)+0.2mg·L-1NAA(萘乙酸)+100μMAS(乙酰丁香...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙红梅，严瑞，王志平，王春夏，李宏宇，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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