基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用技术方案

本发明专利技术提供一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用。针对原本只能应用于无性繁殖作物的外源基因清除技术，改进外源基因清除技术的基础载体，采用效应载体与激活载体组成的双载体形式，将效应载体和激活载体分别作用于不同亲本。效应载体包括标记基因表达框1、重组酶识别序列和重组酶表达框；激活载体包括标记基因表达框2、重组酶识别序列和激活表达框；分别含有效应载体的和含有激活载体的两亲本杂交时，实现特定组织和/或时期中将全部外源基因的清除，使该技术能够应用于有性繁殖作物中的异交繁殖作物，生物安全性高，具有良好的研究和应用前景。

Basic vector of foreign gene scavenging technology based on pOp/LhG two element expression system and its preparation method and Application

The present invention provides a foreign gene scavenging technology basic carrier based on pOp/LhG two element expression system, and its preparation method and application. In view of the foreign gene scavenging technology that can only be used in asexual breeding crops, the basic carrier of extraneous gene scavenging technology is improved, and the two carrier form of effect carrier and activation carrier is used, the effect carrier and the active carrier are acted on the different parents respectively. The effect carrier includes the marker gene expression frame 1, the recombinant enzyme identification sequence and the recombinant enzyme expression frame, and the activation vectors include the marker gene expression frame 2, the recombinant enzyme identification sequence and the activation expression frame, and when the two parents containing the active carrier are hybridized with the effector carrier, the whole and / or all the foreign groups in the period will be realized. Because of its elimination, the technology can be applied to the cross breeding crops in sexual reproduction crops, with high biological safety and good research and application prospects.

【技术实现步骤摘要】
基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用
本专利技术应用于解决转基因植物生态安全及食品安全的问题，属于转基因育种
，具体涉及一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用。
技术介绍
人们对于转基因植物的安全性主要有两方面的忧虑：一是转基因植物的外源基因可能会通过花粉和种子在种群之间扩散，从而影响生态环境和生物多样性。二是转基因食品可能对人体的健康有不良影响。为解决转基因植物生态安全及食品安全的问题和担忧，目前国内外已经发表了以下几种技术：(1)花粉不育技术由于基因漂移主要是通过花粉和种子进行，花粉不育技术可消除由花粉引起的外源基因的逃逸。虽然花粉不育技术可以用于某些无性繁殖的植物，但不能直接用于水稻、玉米等有性繁殖的大田作物。花粉不育可使这些收获种子的作物颗粒无收。同时，花粉不育技术也不能解决种子引起的基因扩散和转基因食品安全等问题。(2)无籽技术种子扩散是外源基因逃逸的另一条重要途径。通过利用特异性启动子与IaaM基因融合，可获得无籽烟草、无籽茄子[5]和无籽瓜果[6]。无籽技术可防止由种子引起的外源基因逃逸，也可大幅度地提高很多瓜果类作物的产量和质量。但该技术同样不能用于水稻、玉米等有性繁殖的大田作物。(3)“终结者”技术“终结者”技术是美国DeltaandPineLand公司研究并经美国专利局1998年3月批准的一项专利[7]，但从未有公开发表的实验数据支持该技术的实际可行性和效果。从理论上讲，该技术可解决转基因植物的外源基因通过种子的扩散问题。“终结者”技术是把一个休眠的种子自杀的基因插入到转基因作物，休眠的自杀基因可以通过化学调控被激活，使农民收获的种子不能正常萌发。由于该技术使农民无法将自收的种子用于来年播种和生产，因此遭到世界各地农民和许多发展中国家的反对[8]。早在1998年，国际农业促进基金会(RAFI)就明确要求美国政府禁止使用终结者技术。另一方面，虽然“终结者”种子技术的概念很好，但根据我们的经验和知识，它的效率会较低，沒有大田的实际应用价值。(4)叶绿体转化技术由于大部分植物的花粉不含叶绿体，外源基因整合进叶绿体基因组后，不会像核基因组那样随花粉转移而扩散到坏境中。因而，将外源基因整合到叶绿体基因组可减轻由花粉引起的外源基因漂移问题。目前，虽然叶绿体转化已在烟草等多种植物上取得成功，但还存在转化周期长、同质化难度大等问题。而且，该技术还不能在许多重要作物上使用[9]。有研究还发现，在一些裸子植物和被子植物(如松树、苜蓿、烟草和水稻等)的花粉中含有叶绿体[10,11]。另外，叶绿体基因组中的基因仍存在着渗透现象[12]。转移频率依赖于混合群体的大小、时间长短及它们之间的杂交频率。并且，叶绿体转化不能阻止由种子引起的外源基因扩散问题以及转基因作物的食品安全问题。(5)无标记基因技术转基因植物带有的抗生素和除草剂抗性标记基因使一些人担心它们对环境和人畜健康的不利影响。利用共转化、转座子、同源重组、位点特异重组酶删除标记基因等方法可以获得无标记基因的转基因植物。其中的一些技术已相当成熟，并被应用到已商品化的转基因作物上。尽管如此，无标记基因等技术并不能解决抗虫、抗草甘膦等外源基因环境和食品安全性的问题。(6)“外源基因清除”技术“外源基因清除”技术(GeneDeletor)利用细菌噬菌体的Cre/LoxP系统和酵母的FLP/FRT系统的有关元件组合了一个新颖的、高效的、能将全部的外源基因在它们完成功能后从转基因植物中彻底清除的系统，从而为解决转基因作物的环境和食品安全问题构建了一个较好的技术平台。LF(即LoxP-FRT)顺序是细菌噬菌体的Cre/LoxP系统的LoxP和酵母的FLP/FRT系统的FRT识别序列的融合顺序。FLP重组酶可识别LF顺序并将两个LF之间的所有的DNA序列删除。花粉和种子特异启动子可用来驱动重组酶基因FLP的表达，目标基因、标记基因及花粉和种子表达的FLP基因等所有的功能基因将被植入两个LF识别序列之间。当植物开花结实时，由于FLP重组酶基因将只在花粉和种子中表达，花粉和种子中存在的全部的外源基因将被彻底清除，只留下没有功能的86个碱基的非编码的LF序列，而其它器官中的外源基因将被保留。“外源基因清除”技术的两个重要特点是：1)由于使用了新颖的loxP-FRT识别序列，使FLP或CreDNA重组酶的删除效率大幅度提高；2)全部的外源基因可在转基因植物的特定器官中被彻底清除，从而可以使转基因植物的花粉、种子、果实或其它食用部分变成非转基因的。在筛选出的转基因植物株系中，如果目标器官，如花粉和种子中，所有的外源基因被100％的去除，那么该株系“外源基因清除”载体的效率就是100％。然后可通过无性的方法繁殖该株系，应用于生产上的推广。然而已发表的“外源基因清除”技术只适用于无性繁殖作物。由于有性繁殖作物在产生花粉、种子的过程中，外源基因将被全部清除，后代植株中不含有外源基因，将失去转基因优势。因此已发表的“外源基因清除”技术不适用于有性繁殖作物，需要在原有技术上进行改进。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：如何改进“外源基因清除”技术的基础载体，使原本只能应用于无性繁殖作物的外源基因清除技术，能够应用于有性繁殖作物中的异交繁殖作物，如玉米、水稻等重要的农作物。本专利技术的第一个目的是提供一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体，该外源基因清除技术基础载体包含效应载体和激活载体；效应载体包括重组酶表达框、标记基因表达框1、重组酶识别序列；重组酶表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的人工启动子pOp、重组酶FLP基因和NOS终止子，重组酶表达框序列如SEQIDNO.1所示；标记基因表达框1包括Ubi启动子、Bar-GUS融合基因、35S终止子，标记基因表达框1序列如SEQIDNO.2所示；重组酶识别序列包括LBloxP-FRT(SEQIDNO.3)和RBloxP-FRT(SEQIDNO.4)；激活载体包括激活表达框、标记基因表达框2、重组酶识别序列；激活表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的转录激活子LhG4基因、NOS终止子，激活表达框序列如SEQIDNO.6所示；标记基因表达框2包括35S启动子、GUS-NPTII融合基因、35S终止子，标记基因表达框2序列如SEQIDNO.7所示；重组酶识别序列与效应载体的相同，包括LBloxP-FRT(SEQIDNO.3)和RBloxP-FRT(SEQIDNO.4)；效应载体和激活载体分别整合在不同的载体pCAMBIA0380上，载体pCAMBIA0380序列如SEQIDNO.5所示。进一步的，重组酶识别序列LBloxP-FRT整合在载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的左边界内侧；重组酶识别序列RBloxP-FRT整合在载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的右边界内侧；重组酶表达框和标记基因表达框1顺序整合在效应载体的重组酶识别序列LBloxP-FRT和RBloxP-FRT之间；激活表达框和标记基因表达框2顺序整合在激活载体的重组酶识别序列LBloxP-FRT和RBloxP-FRT之间。本专利技术的第二个目本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体，其特征在于，所述外源基因清除技术基础载体包含效应载体和激活载体；所述效应载体包括重组酶表达框、标记基因表达框1、重组酶识别序列；所述重组酶表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的人工启动子pOp、重组酶FLP基因和NOS终止子，重组酶表达框序列如SEQ ID NO.1所示；所述标记基因表达框1包括Ubi启动子、Bar‑GUS融合基因、35S终止子，标记基因表达框1序列如SEQ ID NO.2所示；所述重组酶识别序列包括LB loxP‑FRT(SEQ ID NO.3)和RB loxP‑FRT(SEQ ID NO.4)；所述激活载体包括激活表达框、标记基因表达框2、重组酶识别序列；所述激活表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的转录激活子LhG4基因、NOS终止子，激活表达框序列如SEQ ID NO.6所示；所述标记基因表达框2包括35S启动子、GUS‑NPTII融合基因、35S终止子，标记基因表达框2序列如SEQ ID NO.7所示；所述重组酶识别序列与效应载体的相同，包括LB loxP‑FRT(SEQ ID NO.3)和RB loxP‑FRT(SEQ ID NO.4)；所述效应载体和激活载体分别整合在不同的载体pCAMBIA0380上，载体pCAMBIA0380序列如SEQ ID NO.5所示。...

【技术特征摘要】
1.一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体，其特征在于，所述外源基因清除技术基础载体包含效应载体和激活载体；所述效应载体包括重组酶表达框、标记基因表达框1、重组酶识别序列；所述重组酶表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的人工启动子pOp、重组酶FLP基因和NOS终止子，重组酶表达框序列如SEQIDNO.1所示；所述标记基因表达框1包括Ubi启动子、Bar-GUS融合基因、35S终止子，标记基因表达框1序列如SEQIDNO.2所示；所述重组酶识别序列包括LBloxP-FRT(SEQIDNO.3)和RBloxP-FRT(SEQIDNO.4)；所述激活载体包括激活表达框、标记基因表达框2、重组酶识别序列；所述激活表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的转录激活子LhG4基因、NOS终止子，激活表达框序列如SEQIDNO.6所示；所述标记基因表达框2包括35S启动子、GUS-NPTII融合基因、35S终止子，标记基因表达框2序列如SEQIDNO.7所示；所述重组酶识别序列与效应载体的相同，包括LBloxP-FRT(SEQIDNO.3)和RBloxP-FRT(SEQIDNO.4)；所述效应载体和激活载体分别整合在不同的载体pCAMBIA0380上，载体pCAMBIA0380序列如SEQIDNO.5所示。2.根据权利要求1所述的基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体，其特征在于，所述重组酶识别序列LBloxP-FRT整合在载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的左边界内侧；所述重组酶识别序列RBloxP-FRT整合在载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的右边界内侧；所述重组酶表达框和标记基因表达框1顺序整合在效应载体的重组酶识别序列LBloxP-FRT和RBloxP-FRT之间；所述激活表达框和标记基因表达框2顺序整合在激活载体的重组酶识别序列LBloxP-FRT和RBloxP-FRT之间。3.权利要求1或2所述的外源基因清除技术基础载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1.根据已知的loxP和FRT序列，以5’端-插入位置5’端20个碱基的载体序列-loxP-FRT-EcoRI、SmaI酶切位点-插入位置3’端8个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成LBloxP-FRT(SEQIDNO.3)；通过重组连接，将loxP-FRT连入载体pCAMBIA0380(SEQIDNO.5)的T-DNA插入区域的左、右边界之内，紧邻左边界之处，得到载体LF1；S2.根据已知的loxP和FRT序列，以5’端-插入位置5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-loxP-FRT-插入位置3’端20个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成RBloxP-FRT(SEQIDNO.4)；通过重组连接，将RBloxP-FRT连入载体LF1的T-DNA插入区域的左、右边界之内，紧邻右边界之处，得到载体LF2；S3.根据已知的人工启动子pOp、重组酶FLP基因、NOS终止子序列，以5’端-插入位置5’端8个碱基的载体序列-EcoRI、SmaI酶切位点-pOp-SalI酶切位点-FLP-NOS-HindIII酶切位点-插入位置3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成重组酶表达框(SEQIDNO.1)；通过重组连接，将重组酶表达框连入载体LF2，得到加载重组酶表达框的载体LF2；S4.根据已知的Ubi启动子、Bar-GUS融合基因、35S终止子序列，以5’端-插入位置5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-Ubi-Bar-GUS-3’35S-SacI、SpeI、HindIII酶切位点-插入位置3’端2个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成标记基因表达框1(SEQIDNO.2)；通过重组连接，将标记基因表达框1连入加载重组酶表达框的载体LF2，得到效应载体；S5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵德刚，丁静，盖钧镒，李义，翟新秘，吴寒，
申请(专利权)人：贵州大学，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52