转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制及应用制造技术

本发明专利技术公开一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，包括：克隆水稻中OsNramp5基因；以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将所述OsNramp5基因通过同源重组方法插入所述转化载体，获得超量表达双元载体；将所得超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入水稻愈伤组织中，培育转基因苗并筛选转基因阳性植株；其中，转基因受体植株为水稻日本晴品种。本发明专利技术提供的培育方法可解决野生重金属富集植株耐性有限、成长缓慢、生物量小、生长环境特殊以及重金属重返等问题。此外，本发明专利技术还提供一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制中所得的重金属超富集转基因植株在土壤重金属修复中的应用。

Establishment and application of transgenic rice for transgenic rice with OsNramp5 gene in transgenic rice

The invention discloses the creation of a heavy metal hyperconcentration transgenic rice with OsNramp5 gene of Japanese clear rice, which includes the cloning of OsNramp5 gene in rice. Based on the plant expression vector, the transformation vector containing the strong promoter and the screening gene is constructed, and the OsNramp5 gene is inserted through the homologous recombination method. The super expressed double vector was transformed into rice callus through agrobacterium tumefaciens, and transgenic plants were bred and screened for transgenic rice. The cultivation method provided by the invention can solve the problems of limited tolerance, slow growth, small biomass, special growth environment and heavy metal return of the wild heavy metal enrichment plant. In addition, the invention also provides an application of heavy metal hyperconcentration transgenic plants to the remediation of soil heavy metals in the creation of heavy metal hyperconcentration transgenic rice with OsNramp5 gene of Japanese clear rice.

【技术实现步骤摘要】
转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制及应用
本专利技术属于转基因植株和重金属污染治理领域，具体涉及转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制及应用。
技术介绍
重金属污染问题已成为一个世界性重大环境问题，重金属污染不仅威胁动植物、微生物生产发育，还通过食物链等威胁人类健康乃至生命。导致土壤污染的重金属主要有As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg等，一般为几种重金属的复合污染。重金属矿区、经济高速发展区的重金属污染情况尤为严重，导致我国许多农产品由于重金属超标而被拒绝进入国际市场。各国对重金属污染的生态效应和防治的研究越来越重视，已探索出多种治理技术。然而传统的重金属污染技术如土壤固化、玻璃化、淋滤化、洗土法、客土法、电化学法等物理化学方法，不仅成本高昂，难以大规模使用，而且常常导致土壤结构破坏、土壤生物活性下降和土壤肥力退化。因此，寻求一种廉价而永久有效，又可以维持土壤肥力的替换方法一直是国际上研究的难点和热点。利用绿色植物清除污染物的策略，即植物修复技术具有成本低，环境友好和可再利用等特点，是一种非常有前景的环境污染原位治理途径。广义的植物修复指通过植物萃取、转化、固定、挥发、降解作用将土壤及水体中有机污染物、重金属等污染物清除的过程。通过种植具有重金属富集能力的植物，将植物收割并妥善处理(如灰化等)，以到达将重金属移出土壤环境，清除土壤重金属污染的目的。基因是决定植物对土壤重金属吸收积累特性的最重要因素，重金属富集植物耐重金属的机制主要包括三个方面，第一，排斥机制，阻碍重金属的吸收或体内运输，吸收后又排出体外；第二，局域化机制，使重金属在植物的液泡、表皮毛、细胞壁等特定部位积累，从而与细胞中的其他组分隔离，达到解毒的效果；第三，络合机制，植物体内物质与重金属络合，包括与无机物络合形成硫化物，与小分子有机物如GSH、草酸、组氨酸和柠檬酸等络合后在液泡中聚集，与大分子的金属鏊合蛋白络合。但目前，野生重金属富集植株存在耐性有限、成长缓慢、生物量小、生长环境特殊、以及重金属重返等问题。基因工程技术是目前土壤重金属修复研究中最具前景的高新生物技术，因此，将植物的重金属超富集基因克隆并转移到生物量大、生产迅速的植物上以提高植物修复的能力，是解决土壤重金属污染问题的有效方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制及应用，解决野生重金属富集植株存在耐性有限、成长缓慢、生物量小、生长环境特殊、以及重金属重返等问题。为实现上述目的，本专利技术提供一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，具体指重金属超富集转基因工程水稻的构建方法，包括：(1)重金属超富集基因的克隆，克隆水稻中OsNramp5基因。研究结果表明，OsNramp5蛋白对镉、锰等重金属离子具有较强的吸附能力，是水稻富集镉等重金属的关键基因，过量表达该基因能够显著提高水稻对镉等重金属的吸附能力；(2)超量表达双元载体的构建，以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将骤(1)克隆得到的OsNramp5基因通过同源重组方法插入所述转化载体，获得超量表达双元载体；(3)重金属超富集转基因植株构建，将步骤(2)所得的超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入水稻愈伤组织中，用筛选培养基进行筛选培养，获得的转基因抗性水稻愈伤组织经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽，筛选重金属超富集转基因阳性植株；其中，所述OsNramp5基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述转基因工程水稻品种为日本晴。较佳地，所述步骤(1)中，克隆水稻中OsNramp5基因的方法为：以水稻的cDNA为模板，以如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的序列为引物对进行PCR扩增，得到OsNramp5基因。较佳地，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为Ubiquitin启动子，所述筛选基因为Bar筛选基因，所述转化载体还包括3×Flag标签。采用包含Ubiquitin启动子的转化载体，目的基因表达量高，遗传稳定性好，实际应用前景突出，且强化了目标基因的高转化，有望获得目标基因高效转化的转基因材料。另外，添加的3×Flag标签，可方便在蛋白水平进行转化效率及遗传稳定性分析，有望为应用实践筛选出具有持久稳定遗传的转基因株系。较佳地，上述所述转化载体的构建方法包括以下步骤：(a)在所述pCAMBIA1301载体多克隆位点KpnI和SacI之间添加所述3×Flag标签；(b)采用PCR扩增反应克隆所述pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基因；(c)使用内切酶XhoI酶切步骤(a)中获得的载体，并将所述Bar筛选基因与酶切后的载体进行同源重组；(d)采用HindIII和BamHI酶切pUN1301载体上的Ubiquitin启动子；(e)使用内切酶HindIII和BamHI酶切步骤(c)中获得的重组载体，并将所述Ubiquitin启动子与酶切后的重组载体连接。具体地，所述Ubiquitin启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述Bar筛选基因核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，所述3×Flag标签的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。较佳地，步骤(b)中，所述克隆pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基因的PCR引物序列如SEQIDNO：10和SEQIDNO：11所示。较佳地，所述筛选培养基包含草铵膦。较佳地，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为2×CaMV35S启动子，所述筛选基因为HYG筛选基因。采用包含2×CaMV35S启动子的转化载体，目的基因表达量高，遗传稳定性好，实际应用前景突出，且强化了目标基因的高转化，有望获得目标基因高效转化的转基因材料。较佳地，所述HYG筛选基因为所述pCAMBIA1301载体自带的筛选基因，所述转化载体的构建方法包括以下步骤：(a)使用内切酶HindIII和PstI酶切所述pCAMBIA1301载体；(b)使用内切酶HindIII和BamHI酶切所述pCAMBIA1301载体，获得CaMV35S启动子；(c)根据CaMV35S启动子的核苷酸序列设计含有内切酶HindIII和PstI酶切位点的引物，并以CaMV35S启动子为模板进行PCR扩增反应，获得含有HindIII和PstI酶切位点的CaMV35S启动子，并使用内切酶HindIII和PstI对PCR获得的CaMV35S启动子进行酶切；(d)将步骤(c)中获得的酶切产物进行回收，并与步骤(a)中获得的酶切载体连接。具体地，所述2×CaMV35S启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，所述HYG筛选基因的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。较佳地，所述筛选培养基含有潮霉素。较佳地，步骤(2)中，所述超量表达双元载体的构建包括以下步骤：采用PCR扩增反应克隆OsNramp5基因，所述克隆OsNramp5基因的同源重组PCR引物包含BamHI酶切位点。较佳地，所述克隆OsNramp5基因的同源重组PCR引物序列如SEQIDNO：12和SEQIDNO：13所示。较佳地，所述根癌农杆菌为EH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，包括：(1)重金属超富集基因的克隆克隆水稻中OsNramp5基因；(2)超量表达双元载体的构建以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将骤(1)克隆得到的OsNramp5基因通过同源重组方法插入所述转化载体，获得超量表达双元载体；(3)重金属超富集转基因植株构建将步骤(2)所得的超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入水稻愈伤组织中，用筛选培养基进行筛选培养，获得的转基因抗性水稻愈伤组织经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽，筛选重金属超富集转基因阳性植株；其中，所述OsNramp5基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述转基因工程水稻品种为日本晴。

【技术特征摘要】
1.一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，包括：(1)重金属超富集基因的克隆克隆水稻中OsNramp5基因；(2)超量表达双元载体的构建以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将骤(1)克隆得到的OsNramp5基因通过同源重组方法插入所述转化载体，获得超量表达双元载体；(3)重金属超富集转基因植株构建将步骤(2)所得的超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入水稻愈伤组织中，用筛选培养基进行筛选培养，获得的转基因抗性水稻愈伤组织经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽，筛选重金属超富集转基因阳性植株；其中，所述OsNramp5基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述转基因工程水稻品种为日本晴。2.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述步骤(1)中，克隆水稻中OsNramp5基因的方法为：以水稻的cDNA为模板，以如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的序列为引物对进行PCR扩增，得到OsNramp5基因。3.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为Ubiquitin启动子，所述筛选基因为Bar筛选基因，所述转化载体还包括3×Flag标签。4.如权利要求3所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述转化载体的构建方法包括以下步骤：(a)在所述pCAMBIA1301载体多克隆位点KpnI和SacI之间添加所述3×Flag标签；(b)采用PCR扩增反应克隆所述pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基因；(c)使用内切酶XhoI酶切步骤(a)中获得的载体，并将所述Bar筛选基因与酶切后的载体进行同源重组；(d)采用HindIII和BamHI酶切pUN1301载体上的Ubiquitin启动子；(e)使用内切酶HindIII和BamHI酶切步骤(c)中获得的重组载体，并将所述Ubiquitin启动子与酶切后的重组载体连接。5.如权利要求4所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述Ubiquitin启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述Bar筛选基因核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，所述3×Flag标签的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。6.如权利要求4所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，步骤(b)中，所述克隆pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗颜荣，陈坤明，袁博，吴兆锋，李永辉，魏伟，刘捷，白帆，
申请(专利权)人：广东开源环境科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44