一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗体受体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及连接有抗可替宁抗体的嵌合抗体受体及其用途。在表面上呈递嵌合抗体受体的T细胞特异性地分泌针对与其一起添加的可替宁‑偶联的结合分子的靶分子的干扰素γ，并诱导表达靶分子的细胞的细胞死亡。相反，通过施用与可替宁偶联的细胞毒性物质，诱导嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡。因此，根据需要，可以施用与可替宁偶联的细胞毒性物质以除去已经施用的嵌合抗原受体T细胞，从而抑制由于T细胞过度活性引起的免疫副作用。因此，与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体可以有效且安全地用于癌症治疗。

Chimeric antibody receptor linked to anti cotinine antibody and its use

The present invention relates to chimeric antibody receptor connected with anti cotinine antibody and its use. T cells presenting chimeric antibody receptors on the surface specifically secrete interferon-gamma (IFN-gamma), a target molecule for cotinine-coupled binding molecules, and induce cell death of cells expressing the target molecule. On the contrary, chimeric antigen receptor T cells were induced to die by the application of cytotoxic substances coupled with cotinine. Therefore, the cytotoxic substances coupled with cotinine can be applied as needed to remove the chimeric antigen receptor T cells already applied, thereby inhibiting the immune side effects caused by T cell overactivity. Therefore, chimeric antigen receptors linked to anti-cotinine antibodies can be used effectively and safely in cancer treatment.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗体受体及其用途
本专利技术涉及一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗体受体及其用途。
技术介绍
尽管可开发为生物治疗剂的诸如肽、适体、抗体等的物质具有优异的效果，但这些物质容易在体内分解并通过肾脏迅速释放，因此体内半衰期短。为了解决这样的问题，已有研究通过将聚乙二醇(PEG)与其偶联来增加物质的体内半衰期(VeroneseF.M.&PasutG.,DrugDiscov.Today,10,1451-1458,2005)。然而，在偶联PEG的过程中，形成各种分子络合物，并且存在限制，即必须根据与PEG偶联的结合分子建立优化条件。此外，当其目标物体是细胞(例如癌细胞等)时，这样的分子没有细胞毒性或者具有弱细胞毒性的缺点。因此，近来正在开发抗体和细胞毒性物质(抗体-药物偶联物)的偶联物。同时，嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)由抗体的一部分、铰链域、跨膜域和细胞间信号转导域组成。表达CAR(CAR细胞)的免疫细胞例如T细胞和自然杀伤细胞，通过使用CAR的抗体部分特异识别在靶细胞(例如癌细胞等)上表达的表面分子，并且显示对靶细胞的细胞毒性。因此，CAR细胞被用作基因工程细胞疗法的一种形式，并且据报道，表达CAR的T细胞(CART细胞)尤其对表达CD19的恶性血液病显示出高治疗效果。然而，由于常规CAR细胞仅具有识别单个靶分子的限制，因此研究了针对半抗原的CAR细胞。这些细胞表达的CAR使用CAR的抗体部分识别特定半抗原。然后，将具有对靶分子的结合能力的分子(例如肽、适体、抗体、低分子量化学物质等)与半抗原偶联并与这些抗半抗原CAR细胞复合。因此，可以制备多靶向CAR细胞，其中一种类型的CAR细胞可以结合各种靶分子。为了防止表达嵌合抗体受体的细胞与非靶细胞结合，半抗原优选是原本不存在于生物体内的物质。另外，半抗原必须具有用于与结合分子有效偶联的化学官能团。
技术实现思路
技术问题可替宁是尼古丁的一种主要代谢产物，不能在体内生物合成(从头合成)，也不显示生理活性。此外，可替宁在哺乳类动物中的代谢过程已众所周知，并且还报道了可替宁的血清半衰期短至16小时(BenowitsN.L.etal.,3rdHandb.Exp.Pharmacol.,29-60,2009)。因此，即使在吸烟者的情况下，可替宁也可以用作半抗原，因为在吸烟停止几天后可替宁不再存在于体内。此外，由于具有羧基官能团的可替宁容易获得，所以可以促进可替宁与结合分子的偶联。正因为如此，通过制备表达与抗可替宁抗体部分结合的CAR和可替宁-偶联结合分子的T细胞，本专利技术人证实了CART细胞特异性识别可替宁-偶联的结合分子的靶标，分泌干扰素γ，并诱导靶细胞的细胞死亡(图1)。另外，近来随着抗肿瘤CART细胞疗法的增效作用，由于这种基因工程化T细胞的过度活性而引起的免疫毒性被强调为不良副作用。因此，正在研究通过在不良副作用发生时诱导这些细胞的细胞死亡来解决由这些T细胞引起的严重不良副作用的措施。在抗半抗原CAR的情况下，当注射CART细胞的患者体内发生免疫毒性副作用时，注射半抗原-偶联的细胞毒性物质而不是半抗原-偶联的结合分子可以诱导CART细胞的细胞死亡，因为半抗原-偶联的细胞毒性物质仅结合抗半抗原CART细胞。因此，该系统提供了另一个优点，即半抗原-偶联的细胞毒性物质可以用作安全措施以解决由T细胞引起的不良副作用(图2)。因此，本专利技术人证实嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡是由可替宁-偶联的细胞毒性物质诱导，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术的目的是提供一种与抗可替宁抗体连接的CAR。本专利技术的另一个目的是提供一种编码CAR的核酸分子，包含其的表达载体和病毒以及用该病毒转导的细胞。本专利技术的另一个目的是提供一种在所述细胞中还包含可替宁-偶联的结合分子的CAR细胞。本专利技术的另一个目的是提供一种用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物组合物，所述药物组合物包含CAR细胞作为有效成分。本专利技术的另一个目的是提供一种用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的方法，所述方法包括将CAR细胞施用于对象。本专利技术的另一个目的是提供一种用于诱导CAR细胞的细胞死亡的方法。技术手段为了实现上述目的，本专利技术提供了与抗可替宁抗体连接的CAR，该CAR包含抗可替宁抗体或其片段、铰链域、跨膜域和信号转导域。另外，本专利技术提供了编码所述CAR的核酸分子。另外，本专利技术提供了包含所述核酸分子的表达载体。另外，本专利技术提供了包含所述核酸分子的病毒。另外，本专利技术提供了用所述病毒转导的细胞。另外，本专利技术提供了在所述细胞中含有可替宁-偶联的结合分子的CAR细胞。另外，本专利技术提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述CAR细胞作为有效成分。另外，本专利技术提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的方法，所述方法包括将所述CAR细胞施用于对象。此外，本专利技术提供了用于在对象中制备CAR细胞的方法，所述方法包括将所述细胞施用于对象，并将可替宁-偶联的结合分子施用于对象。另外，本专利技术提供了用于诱导CAR细胞的细胞死亡的方法，该方法包括将所述细胞和可替宁-偶联的结合分子施用于对象，并且还将可替宁-偶联的细胞毒性物质施用于所述对象。此外，本专利技术提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物试剂盒，所述药物试剂盒包含以药物和治疗有效量含有所述CAR细胞作为有效成分的第一成分，以及以药物和治疗有效量含有可替宁和细胞毒性物质复合物作为有效成分的第二成分。有益效果本专利技术所述的在其表面上呈递与抗可替宁抗体连接的CAR的T细胞，特异性地识别可替宁-偶联的结合分子的靶标，分泌干扰素γ，并且诱导表达靶分子的细胞的细胞死亡。此外，通过施用可替宁-偶联的细胞毒性物质，诱导CART细胞的细胞死亡。因此，当需要时，可以通过施用可替宁-偶联的细胞毒性物质来去除预先施用的CART细胞，由此抑制由于T细胞的过度活性而导致的不良免疫副作用。因此，与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体可以有效地用于治疗特定细胞增殖的病症或疾病。附图说明图1是显示通过根据靶细胞改变可替宁-偶联的结合分子来改变嵌合抗原受体T细胞的靶标的图。图2是显示可替宁-偶联的细胞毒性物质用于诱导嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡的图。图3显示了与根据本专利技术实施例制备的抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体基因(Cot-28Z)和表达其的病毒载体(pMP-Cot-28Z)的结构(A)，以及通过流式细胞仪分析在其表面上呈递嵌合抗原受体的T细胞的结果图表(B)。图4是显示当本专利技术实施例制备的连接有抗可替宁抗体片段的嵌合抗原受体T细胞与可替宁-偶联的抗-VEGF适体(Cot-哌加他尼)混合，并与靶分子即VEGF蛋白反应时，由T细胞分泌的干扰素γ的量的图表。图5是显示当根据本专利技术实施例制备的嵌合抗原受体T细胞与可替宁-偶联的抗-HER2抗体(抗-HER2-Cot)混合，并添加到HER2阳性或阴性肿瘤细胞时，由T细胞分泌的干扰素γ的量的图表。图6是(A)显示证实了与根据本专利技术的实施例制备的可替宁-偶联的抗-HER2抗体(赫赛汀-cot)与嵌合抗原受体T细胞混合后的HER2阳性肿瘤特异性地分泌干扰素γ的图表，以及显示通过流式细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含：抗可替宁抗体或其片段；铰链域；跨膜域；和信号转导域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.17 US 62/205,8441.一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含：抗可替宁抗体或其片段；铰链域；跨膜域；和信号转导域。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述片段是抗可替宁抗体的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、或scFv。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗可替宁抗体或其片段包括：包含CDR1，CDR2或CDR3的重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQIDNO：23至25的氨基酸序列表示；或者包含CDR1，CDR2或CDR3的轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQIDNO：26至28的氨基酸序列表示。4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗可替宁抗体的片段具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链域选自：CD8铰链域、IgG1铰链域、IgG4铰链域、CD28胞外区、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)胞外区，及其组合。6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8铰链域具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜域是CD3ζ、CD4、CD8、CD28或杀伤免疫球蛋白样受体蛋白的跨膜域。8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜域包括CD28的跨膜域。9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD28的跨膜域具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的氨基酸序列。10.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导域是CD3ζ、CD278(可诱导T细胞共刺激分子，ICOS)、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)或DNAX活化蛋白12(DAP12)。11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导域是CD28和CD3ζ的细胞质区。12.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导域是CD137(4-1BB)和CD3ζ的细胞质区。13.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD28的细胞质区具有SEQIDNO:9或SEQIDNO:11的氨基酸序列。14.根据权利要求11或12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD3ζ的细胞质区具有SEQIDNO:13的氨基酸序列。15.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的氨基酸序列。16.一种编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的核酸分子。17.一种包含权利要求16所述的核酸分子的表达载体。18.根据权利要求17所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是病毒载体。19.根据权利要求18所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。20...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔景镐，朴烔培，李知垠，吴侑躾，金起铉，金洙铉，金孝悧，郑埈昊，
申请(专利权)人：首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR