一种低pH孵育病毒灭活的验证方法技术

本发明专利技术涉及一种低pH孵育灭活病毒的验证方法，选择指示病毒及其对应的宿主细胞；指示病毒扩增和纯化；病毒工作原液和样品的滴度测定；灭活病毒验证实验pH值的优化；低pH值孵育灭活病毒效果评估。本发明专利技术所提供的方法，能实现实验室摸拟基因工程药物生产工艺病毒灭活的全过程，优化了指示病毒的扩增、纯化工艺，使指示病毒工作原液滴度提高，pH值统一到7.0，质量稳定而益于后续操作，同时优化了低pH孵育的具体技术细节(如最优孵育pH值的确定，pH调节方式的优化等)，提高对常见的DNA病毒、RNA病毒、有包膜病毒和无包膜病毒灭活的有效性和实效性。

A verification method for inactivation of low pH incubation virus

The invention relates to a test method of low pH incubation inactivated virus, selecting the virus and its corresponding host cells, indicating virus amplification and purification, testing the titer of the virus working liquid and sample, the optimization of the pH value of inactivated virus verification experiment, and the evaluation of the effect of the inactivated virus on the low pH incubation inactivated virus. The method provided by this invention can realize the whole process of virus inactivation in the laboratory of gene engineering drug production in laboratory, optimize the amplification and purification process of the virus, make the titer of the virus working liquid increase, the pH value is unified to 7, the quality is stable and the subsequent operation is stable, and the specific technology of low pH incubation is optimized. Details (such as the determination of the optimal incubating pH value, the optimization of the pH regulation mode, etc.) can improve the effectiveness and effectiveness of the inactivation of the common DNA virus, the RNA virus, the enveloped virus and the non enveloped virus.

【技术实现步骤摘要】
一种低pH孵育病毒灭活的验证方法
本专利技术属于生物
，具体的，本专利技术涉及一种用于基因工程药物/生物制品生产工艺的低pH孵育病毒灭活的验证方法。技术背景随着21世纪生物技术的发展，动物源性组织、细胞、体液及基因工程真核细胞表达制备的生物制品逐渐增多，使用的人群不断扩大，加之动物源性产品原材料质量控制未引起足够重视，生产工艺又基本没有经过严格的病毒去除/灭活效果验证。因此，目前动物源性病毒感染人类的风险性极高，潜在病源性感染问题变得日益突出。其中动物组织来源制品由于动物本身健康检疫状况差，不同动物携带的病毒外源因子复杂多变，可控性因素尚不确定，对人体的潜在危害性较之经过系统鉴定和严格控制的基因工程真核细胞表达制品的风险性更高。而基因工程生物制品由于其原材料也易受到病毒污染(如来源于人类、动物的组织、血液、细胞等)，其生产过程中使用或添加了可能含有外源病毒因子的材料(如动物血清、胰酶等)，产品原辅材料的病毒质量控制未引起足够重视等原因，其相关风险也不容忽视。迄今，全球销售额最高的6类生物技术药物，分别是肿瘤治疗药物、抗肿瘤坏死因子α药物、促红细胞生成素、胰岛素、β-干扰素和凝血因子。这6类生物药物除β-干扰素由大肠杆菌和酵母表达外，其余5类都是经哺乳动物细胞表达生产。动物细胞大规模培养是当前基因工程药物生产的主流方式。狂犬病毒、甲肝病毒等病毒灭活疫苗、乙型脑炎病毒等减毒活疫苗的生产也都必须在动物细胞系中扩增毒种。由于细胞是具有生命属性的活生命体，培养条件非常苛刻，生长周期比较长，易被无孔不入的微生物污染。尤其是细胞培养需加入很多培养基质，如培养基、血清、生长因子等，这些基质多种多样，多来自人源、动物源材料，使病毒潜在污染的风险明显增加。己证明血液制品中经常发现有HBV、HCV、HIV、HTLV等病毒的污染。为了提高基因工程药品的生物安性，在基因工程药物/生物制品生产工艺中增加病毒灭活步骤是必然趋势。根据《药品注册管理办法》的要求，由人的、动物的组织或者体液提取的制品、动物源性单克隆抗体及真核细胞表达的重组制品，需增加病毒灭活工艺验证资料。因此国家食品药品监督管理局和药品审评中心先后于2002年和2005年发布《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》和《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》，要求基因工程药物/生物制品生产工艺必须包含病毒去除/灭活的有效工艺步骤，并对其方法和要点做了原则性的指导。其中，低pH孵育法就是一种有效的病毒灭活/去除工艺，可用于血液制品和其他药物/生物制品生产中。但这两个指导文件并没有对低pH孵育灭活病毒的验证实验的技术细节做出严格规格，尤其是pH的具体范围，检测参数，评估体系；指示病毒的选择等。本专利技术就是针对基因工程药物/生物制品生产工艺中病毒灭活与验证新技术的建立而提出的，具有实用性强，应用广泛的特点，建立了一套完备、高效的低pH孵育病毒灭活与验证技术体系。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种低pH孵育灭活病毒的验证方法。为了达成上述的目的，本专利技术提供一种低pH孵育灭活病毒的验证方法，包括以下步骤：1)选择指示病毒及其对应的宿主细胞：选择伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)、鼠白血病病毒(MuLV)、水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus，VSV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)为指示病毒；选择指示病毒相对应的宿主细胞，伪狂犬病毒对应的为猪肾细胞(PK-15)，鼠白血病病毒对应的为猫星型细胞(PG4)，水疱性口炎病毒对应的为非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞，猪细小病毒对应的为猪肾细胞(IBRS-2)；2)指示病毒扩增和纯化：常规扩增收样后超速离心换用新鲜无血清MEM培养基溶解，使其病毒滴度提高，pH值统一为7.0；3)病毒工作原液和样品的滴度测定：采用TCID50法或实时荧光定量RT-PCR法进行滴度测定；4)灭活病毒验证实验pH值的优化：通过预实验确定了指示病毒最优的孵育pH以及pH值的最佳调节方式；5)低pH值孵育灭活病毒效果评估：用阳牲对照的病毒滴度减去实时取样样品中的病毒滴度，获得不同取样时间点的病毒灭活定量数据(LRV，log/ml)，若该时间点的LRV≥4，则低pH孵育该时间的灭活工艺灭活病毒有效。进一步地，其中步骤2)所述指示病毒的扩增和纯化具体包括如下步骤：将各宿主细胞分别接种在含有10％(v/v)FBS的MEM培养基的T75细胞培养瓶中，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；当宿主细胞汇合度达到80％-90％时，弃掉细胞上清，加入10-4-10-1稀释度的相应病毒液3ml，37℃吸附1～2h；吸附结束后，弃掉病毒液于巴氏液中，用无血清的MEM培养基清洗细胞一遍，再用含有2％(v/v)FBS的MEM培养基培养36-48h左右，当宿主细胞发生80％以上严重病变(CPE)但没有完全病变漂浮时，对细胞进行破碎，4℃3000g离心10min去除细胞碎片，收集上清，再用0.22μm滤器过滤后即为无菌的病毒种子原液；取上述上清4℃，72,000g超速离心4h后，弃上清，沉淀用超速离心前原体积的1/5-1/2无血清MEM(pH＝7.0)溶解，使得病毒工作原液的pH统一调节为7.0。进一步地，其中所述细胞的破碎方法为：当宿主细胞发生80％以上严重病变(CPE)但没有完全病变漂浮时，将整个T75瓶子冻入-70℃超低温冰箱，并在-70℃和37℃水浴反复冻融3次，每次冻融时间为30min-1h，且首次-70℃水浴冻融过夜；或者将宿主细胞直接用超声波进行破碎。进一步地，其中其中步骤3)所述病毒工作原液和样品的滴度测定具体包括如下步骤：根据低pH孵育法病毒灭活验证实验的需求分装病毒工作原液，同时以1ml/支分装并进行滴度测定；对于CPE明显的病毒，采用TCID50法进行滴度测定，而对于CEP不明显或滴度不高的病毒，采用实时荧光定量RT-PCR法测定滴度；所述TCID50法测定病毒滴度时，参照Reed-Muench方法，计算工作原液或样品病毒TCID50；所述实时荧光定量RT-PCR法测定病毒滴度时，通过比对标准曲线获得样品结果相应RNA拷贝数，以公式1000vRNA拷贝数/ml＝1pfu感染性滴度/ml换算工作原液或样品病毒滴度。进一步地，其中所述TCID50测定法具体包括如下步骤：细胞悬液制备：取宿主细胞T75瓶2-3瓶，弃上清液，每瓶加3ml，0.25％胰酶，37℃消化2～5min，待细胞完全脱壁后加入6ml细胞生长培养基，充分分散细胞；取样显微计数，调整细胞浓度为2×105/ml备用；细胞接种与培养：取96孔细胞培养板若干块，视测定病毒的种类接种制备好的宿主细胞悬液，0.1ml/孔；细胞培养板置37℃，5％(v/v)CO2的培养箱中培养24～36hr，当细胞长成70％左右的单层即可用于病毒接种；病毒稀释：将待测病毒液于3℃水浴锅迅速化冻后，在15ml无菌离心管内作连续10倍稀释，即用2ml吸管吸或移液器取0.5ml病毒液，加到装有4.5mlMEM的第1支离心管内(10-1)，充分混匀后，更换吸管，吸取0.5ml加入第2支离心管内，连续如此操作，继本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选择指示病毒及其对应的宿主细胞：选择伪狂犬病毒、鼠白血病病毒、水疱性口炎病毒、猪细小病毒为指示病毒；选择指示病毒相对应的宿主细胞，伪狂犬病毒对应的为猪肾细胞，鼠白血病病毒对应的为猫星型细胞，水疱性口炎病毒对应的为非洲绿猴肾细胞细胞，猪细小病毒对应的为猪肾细胞；2)指示病毒扩增和纯化：常规扩增收样后超速离心换用新鲜无血清MEM培养基溶解，使其病毒滴度提高，pH值统一为7.0；3)病毒工作原液和样品的滴度测定：采用TCID50法或实时荧光定量RT‑PCR法进行滴度测定；4)灭活病毒验证实验pH值的优化：通过预实验确定了指示病毒最优的孵育pH以及pH值的最佳调节方式；5)低pH值孵育灭活病毒效果评估：用阳牲对照的病毒滴度减去实时取样样品中的病毒滴度，获得不同取样时间点的病毒灭活定量数据(LRV，log/ml)，若该时间点的LRV≥4，则低pH孵育该时间的灭活工艺灭活病毒有效。

【技术特征摘要】
1.一种低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选择指示病毒及其对应的宿主细胞：选择伪狂犬病毒、鼠白血病病毒、水疱性口炎病毒、猪细小病毒为指示病毒；选择指示病毒相对应的宿主细胞，伪狂犬病毒对应的为猪肾细胞，鼠白血病病毒对应的为猫星型细胞，水疱性口炎病毒对应的为非洲绿猴肾细胞细胞，猪细小病毒对应的为猪肾细胞；2)指示病毒扩增和纯化：常规扩增收样后超速离心换用新鲜无血清MEM培养基溶解，使其病毒滴度提高，pH值统一为7.0；3)病毒工作原液和样品的滴度测定：采用TCID50法或实时荧光定量RT-PCR法进行滴度测定；4)灭活病毒验证实验pH值的优化：通过预实验确定了指示病毒最优的孵育pH以及pH值的最佳调节方式；5)低pH值孵育灭活病毒效果评估：用阳牲对照的病毒滴度减去实时取样样品中的病毒滴度，获得不同取样时间点的病毒灭活定量数据(LRV，log/ml)，若该时间点的LRV≥4，则低pH孵育该时间的灭活工艺灭活病毒有效。2.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，步骤2)所述指示病毒的扩增和纯化具体包括如下步骤：将各宿主细胞分别接种在含有10％(v/v)FBS的MEM培养基的T75细胞培养瓶中，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；当宿主细胞汇合度达到80％-90％时，弃掉细胞上清，加入10-4-10-1稀释度的相应病毒液3ml，37℃吸附1～2h；吸附结束后，弃掉病毒液于巴氏液中，用无血清的MEM培养基清洗细胞一遍，再用含有2％(v/v)FBS的MEM培养基培养36-48h左右，当宿主细胞发生80％以上严重病变(CPE)但没有完全病变漂浮时，对细胞进行破碎，4℃3000g离心10min去除细胞碎片，收集上清，再用0.22μm滤器过滤后即为无菌的病毒种子原液；取上述上清4℃，72,000g超速离心4h后，弃上清，沉淀用超速离心前原体积的1/5-1/2无血清MEM(pH＝7.0)溶解，使得病毒工作原液的pH统一调节为7.0。3.如权利要求2所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，所述细胞的破碎方法为：当宿主细胞发生80％以上严重病变(CPE)但没有完全病变漂浮时，将整个T75瓶子冻入-70℃超低温冰箱，并在-70℃和37℃水浴反复冻融3次，每次冻融时间为30min-1h，且首次-70℃冰箱过夜；或者将宿主细胞直接用超声波进行破碎。4.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，其中步骤3)所述病毒工作原液和样品的滴度测定具体包括如下步骤：根据低pH孵育法病毒灭活验证实验的需求分装病毒工作原液，同时以1ml/支分装并进行滴度测定；对于CPE明显的病毒，采用TCID50法进行滴度测定，而对于CEP不明显或滴度不高的病毒，采用实时荧光定量RT-PCR法测定滴度；所述TCID50法测定病毒滴度时，参照Reed-Muench方法，计算工作原液或样品病毒TCID50；所述实时荧光定量RT-PCR法测定病毒滴度时，通过比对标准曲线获得样品结果相应RNA拷贝数，以公式1000vRNA拷贝数/ml＝1pfu感染性滴度/ml换算工作原液或样品病毒滴度。5.如权利要求4所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，其中所述TCID50测定法具体包括如下步骤：细胞悬液制备：取宿主细胞T75瓶2-3瓶，弃上清液，每瓶加3ml，0.25％胰酶，37℃消化2～5min，待细胞完全脱壁后加入6ml细胞生长培养基，充分分散细胞；取样显微计数，调整细胞浓度为2×105/ml备用；细胞接种与培养：取96孔细胞培养板若干块，视测定病毒的种类接种制备好的宿主细胞悬液，0.1ml/孔；细胞培养板置37℃，5％(v/v)CO2的培养箱中培养24～36hr，当细胞长成70％左右的单层即可用于病毒接种；病毒稀释：将待测病...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁冰，李姣，丛娜，刘传桂，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42