一种新型嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型嵌合抗原受体及其应用。所述的新型嵌合抗原受体由信号肽、抗原结合结构域、跨膜区和胞内信号结构域组成，包含4‑1BB信号肽和/或4‑1BB分子跨膜区。本发明专利技术分离纯化了多种嵌合抗原受体核酸序列，并提供了一种特异性针对CD19恶性肿瘤抗原的嵌合抗原受体及CAR‑T细胞。在血液细胞系恶性肿瘤杀伤试验中，明显加强了免疫细胞靶向识别肿瘤细胞的能力，也增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

A new type of chimeric antigen receptor and its application

The invention discloses a novel chimeric antigen receptor and its application. The new chimeric antigen receptor is composed of signal peptide, antigen binding domain, transmembrane region and intracellular signal domain, including 4 1BB signal peptide and / or 4 1BB molecule transmembrane region. The present invention separates and purify a variety of chimeric antigen receptor nucleic acid sequences, and provides a specific chimeric antigen receptor for CD19 malignant tumor antigen and CAR T cells. In the blood cell line malignant tumor killing test, the ability of the immune cells to target the tumor cells is obviously enhanced, and the killing activity of the tumor cells is enhanced.

【技术实现步骤摘要】
一种新型嵌合抗原受体及其应用
本专利技术属于生物医学或生物制药
，涉及一种新型嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
据《2015全球癌症统计》数据显示，2012年全球新增1410万肿瘤患者，820万患者死亡。据中国肿瘤登记中心的数据显示，2015年中国新增430万癌症病例，癌症死亡病例超过281万，占据全年死亡人数比例的28.82％，即平均每天就有超过7500人死于癌症，居于世界首位。传统的肿瘤治疗手段主要有手术、放射治疗、化疗，以及近年兴起的干细胞移殖等，往往这些治疗手段治标不治本。随着科学的发展，肿瘤的免疫治疗近年来实现了巨大的突破，其中主要包括免疫检查点抑制剂(例如anti-PD1单克隆抗体)，以及嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(ChimericAntigenReceptorModifiedTcelltherapy，CAR-T)的临床效果最好。近年来，CAR-T技术在血液性疾病治疗临床试验取得了令人鼓舞的进展，被《Science》杂志评为2013年十大科学突破之首。从2013年宾夕法尼亚大学CarlJune小组报道第一例使用靶向CD19CAR-T治疗患有急性B淋巴细胞性白血病的儿童(EmilyWhitehead)得到完全缓解开始，短短几年时间CAR-T细胞免疫疗法发展迅猛。CAR-T细胞治疗是当前靶向性最高、疗效最好的细胞免疫疗法。经过技术演变之后，CAR-T已经变得更加灵敏、免疫持续性更久，对淋巴瘤等血液肿瘤具有奇效。目前有多个细胞治疗方法已被FDA授予“突破性疗法”资格，其中，多项临床试验研究结果表明，CD19CAR-T治疗B细胞淋巴瘤的临床完全缓解率均已经超过90％。CAR-T细胞是能够经过基因工程手段在T细胞表面表达识别特定抗原并且传递信号的一类T细胞。一般地，CAR-T细胞通过嵌合抗原受体CAR以抗原-抗体或配体-受体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别，然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。经嵌合抗原受体修饰的T细胞，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。经修饰的T细胞表达这样的一类嵌合抗原受体分子：胞外段一般包含CD8α或GM-CSFRα信号肽，抗原识别区或抗原结合结构域，包含由抗体重链和轻链可变区组成的单链可变区；胞内段是各种信号传导分子的胞内段嵌合体，包括CD28、4-1BB、OX-40、CD3zeta等，跨膜区则来自其他分子，如PD1、CD8、CD4、CD28、CD3zeta(CD3ζ)等。CAR胞外区部分的非抗原识别区，包括信号肽，铰链区(Hinge，scFv和跨膜区之间的连接区，亦有称间隔区spacerdomain)，对于CAR的功能有重要的影响。德国KoberL等人报道通过优选不同来源的信号肽序列对可使双特异性单链抗体(Bi-specificscFvantibody)的表达水平显著提升，这与信号肽引导蛋白进入分泌途径的能力有密切的关系(BiotechnolBioeng.2013Apr；110(4):1164-73.)。美国FredHutchinsonCancerResearchCenter的MichaelHudecek等人报道，使用不合适的间隔区的CAR尽管在体外实验中有良好的肿瘤细胞杀伤作用，但是在体内由于间隔区与Fc受体有结合作用，导致CAR-T细胞在体内发生被激活引起的T细胞死亡现象(Activation-inducedT-Celldeath)，导致这样的CAR构造在体内不能持续存在而丧失抗肿瘤活性(CancerImmunolRes；3(2)；125-35.)。国际申请WO2016/014789A2中，不改变胞外抗原识别区和胞内信号区，仅通过改变跨膜区的序列，即可大幅度实现CAR载体的性能，降低CAR-T对非靶细胞的非特异杀伤作用。目前在CAR-T领域，与CD28胞内信号结构域相比，包含4-1BB胞内信号结构域的CAR结构被认为具有更好的体内肿瘤细胞杀伤活性和持续性。在B细胞白血病领域，CD19表达于几乎所有的B细胞肿瘤细胞表面，而在其他实质性细胞和造血干细胞中几乎不表达，CD19是B系肿瘤抗原比较特异的靶标。目前在临床上取得重要进展的CD19CAR结构为CD8α信号肽-抗CD19单链抗体-CD8α铰链区&跨膜区-4-1BB胞内区-CD3ζ胞内区(CD8αsignalpeptide-antiCD19scFv-CD8αHinge&TM-4-1BBcyto-CD3ζ)。人4-1BB分子(NCBI数据库蛋白编号NP_001552.2)，又称CD137，或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember9，TNFRSF9)其一级结构为1-23号氨基酸为信号肽，24-186号氨基酸为胞外区，187-213号氨基酸为跨膜区，214-255号氨基酸为胞内区。目前尚未见报道使用4-1BB的基本结构进行CAR的设计。本专利技术提供一种新型的CAR结构，包含4-1BB信号肽和/或4-1BB跨膜区结构，例如4-1BB信号肽-肿瘤抗原识别结合区-4-1BB跨膜区-4-1BB胞内区-CD3zeta胞内区(4-1BBsignalpeptide-VH-Linker-VL/VHH-4-1BBTM-4-1BBcyto-CD3ζ)，最大限度地使用4-1BB的氨基酸序列。使用4-1BB信号肽和4-1BB的跨膜区及胞内区，利于CAR-T细胞上胞外肿瘤抗原识别结合区的延展得到优化，不仅在体外和体内有良好的肿瘤杀伤作用，而且在临床治疗急性淋巴瘤病人也实现了完全缓解，而且细胞因子释放反应更为温和。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新型嵌合抗原受体及其应用。本专利技术的另一目的是提供编码该嵌合抗原受体的核酸。本专利技术的又一目的是提供含有该嵌合抗原受体的细胞及其应用。一种新型嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，其中所述胞外信号肽选自4-1BB信号肽、CD8α信号肽、GM-CSFRα信号肽或CD4信号肽中的一种，跨膜结构域选自4-1BB分子跨膜区序列。所述跨膜结构域4-1BB分子跨膜区的氨基酸序列优选SEQIDNO.1所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。所述的胞外信号肽氨基酸序列优选如SEQIDNO.2所示的4-1BB信号肽，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。所述的抗原结合域结合的抗原与恶性肿瘤有关，包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-Ireceptor、EPCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、PD1、CTLA4、IGF1R、mesothelin、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGEA3、GPC3、糖脂F77或其他任意肿瘤抗原或其他修饰类型或组合。所述的抗原结合结构域结合的抗原进一步优选为CD19；CD19抗原结合结构域氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，其中所述胞外信号肽选自4‑1BB信号肽、CD8α信号肽、GM‑CSFRα信号肽或CD4信号肽中的一种，跨膜结构域选自4‑1BB分子跨膜区序列。

【技术特征摘要】
1.一种新型嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，其中所述胞外信号肽选自4-1BB信号肽、CD8α信号肽、GM-CSFRα信号肽或CD4信号肽中的一种，跨膜结构域选自4-1BB分子跨膜区序列。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述跨膜结构域4-1BB分子跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述的胞外信号肽选自氨基酸如SEQIDNO.2所示的4-1BB信号肽，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其抗原结合结构域抗体选自单克隆抗体、Fab、scFv或VHH。5.根据权利要求1或4所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述的抗原结合域结合的抗原与恶性肿瘤有关，包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-Ireceptor、EPCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、PD1、CTLA4、IGF1R、mesothelin、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGEA3、GPC3、糖脂F77或其他任意肿瘤抗原或其他修饰类型或组合。6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于抗原结合结构域结合的抗原为CD19。7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述抗原结合结构域包含SEQIDNO.9所示的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于胞内信号结构域包含胞内信号传导结构域和/或共刺激信号结构域，选自以下信号分子的细胞内结构域：CD3ζ、CD3gamma、CD3delta、CD3epsilon、commonFcRgamma、FcRbeta、CD79a、CD79b、FcgammaRIIa、DAP10、DAP12、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD2、淋巴细胞功能相关抗原-1、LIGHT、NKG2C、B7-H3、PD-1、ICOS、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM、SLAMF7、CD7、NKp80、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2Rbeta、IL2Rgamma、IL7Ralpha、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRAN...

【专利技术属性】
技术研发人员：范晓虎，庄秋传，王平艳，杨蕾，郑修军，郝佳瑛，刘少波，
申请(专利权)人：南京传奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32