结核分枝杆菌变态反应原组合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种结核分枝杆菌变态反应原组合物及其制备方法与应用。本发明专利技术的结核分枝杆菌变态反应原组合物由CFP10融合蛋白和Esat‑6重组蛋白(SEQ ID NO:2)等量混合而成。其中，所述CFP10融合蛋白是由n个如SEQ ID NO:3所示的结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3874的T细胞表位肽之间通过Linker串联得到。按照上述设计合成基因序列，转入原核表达系统，表达蛋白质，纯化后等量混合，作为皮试反应原，用于结核病感染的诊断等相关领域。

Allergen composition of Mycobacterium tuberculosis and preparation method and application thereof

The invention provides a Mycobacterium tuberculosis allergen composition and a preparation method and application thereof. The Mycobacterium tuberculosis allergen composition of the invention is made up of CFP10 fusion protein and Esat SEQ 6 recombinant protein (SEQ ID NO:2). Among them, the CFP10 fusion protein is obtained by a series of Linker in series between n T cell epitopes of the Mycobacterium tuberculosis antigen protein Rv3874, as shown by SEQ ID NO:3. According to the above design synthesis gene sequence, the protein was transferred into the prokaryotic expression system, the protein was expressed, and the purified protein was mixed, as a skin test reactivity. It was used in the diagnosis of tuberculosis infection and other related fields.

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌变态反应原组合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及一种结核分枝杆菌变态反应原组合物及其制备方法与应用。
技术介绍
结核病是慢性传染性疾病。目前全球已有20亿人感染结核菌，活动性结核患者达1500万，每年新发结核患者达800万～1000万，有180万人因结核病死亡。1993年世界卫生组织(WHO)宣布“全球结核病处于紧急状态”，将结核病列为重点控制传染病之一。1998年WHO再次指，“遏制结核病行动刻不容缓”。据WHO《2008年全球结核病控制报告》估计，2006年我国结核病发病人数为131万，占全球的14.3％，位居全球第二位，是全球22个结核病高负担国家之一。2010年全国结核病流行病学抽样调查结果显示，我国结核病疫情特点是：感染人数多，全国有5亿人口已感染结核菌，明显高于全球平均感染水平；患者数多，全国有活动性肺结核患者约500-600万，其中传染性肺结核患者约86万；死亡人数多，农村患者多，全国约80％肺结核患者在农村，而且主要集中在中西部地区；耐药患者多，特别是耐多药和广泛耐药患者人数多。在我国传染病疫情网络报告中，肺结核报告发病和报告死亡数位居甲、乙类传染病前列。肺结核患者中的3/4为最具有劳动能力的青壮年。结核病仍是制约农村地区特别是贫困地区经济和社会发展的重大疾病之一。同时，我国结核病防治工作还面临着流动人口结核病、耐多药结核病和结核菌/艾滋病病毒双重感染等新的挑战。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。潜伏期4～8周。其中80％发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。随着环境污染和艾滋病的传播，结核病发病率越发强烈。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。WHO估计每年大约有300万的结核患者未被检测到，不仅使得结核感染患者不能及时诊治，同时也加大了家庭和社会群体之间的传播风险。不利因素提醒我们在结核病控制中早期筛查尤为重要，在《柳叶刀》的一篇结核相关文献中，提出了一个重要的观念变革--在世界范围内推广“在高危群体中去主动发现病人。”结核的高危人群主要包括两类。一是和结核确诊患者有密切接触的亲属和在共同生活环境中的人员；二是基于各国结核病流行趋势不同的特定人群。现存的发现结核病例的方式主要是被动的发现，即等着患者(如果经济条件和医疗条件允许)自己来寻求医疗救治。这种方式虽然能发现大量的患者，但寻求救治的患者一般已有了明显的症状，可能早就在家庭、群体之间发生了传播。大量没有寻医的患者对公众健康存在极大的隐患。针对确诊的患者的亲属和与其密切接触的人员：一旦发现了结核患者，就应该要求其亲属和与其有密切接触的人员到医疗机构进行结核病筛查。同时，也需在条件允许的情况下主动去患者的家庭及其生活环境中进行筛查。根据结核病感染的特点，具体选择高危人群进行筛查。1)HIV患者：虽然我国整体的HIV发病率达不到5％,但因为HIV感染的人数逐年上升，临床中应该提高门诊HIV患者的重视程度，尽可能对其进行结核病筛查。2)选择结核病高发区域进行普查。我国是结核病高负荷国家之一，且是人口大国，进行结核病普查显然是不现实的。因此，基于各地区结核发病率的差异，选择发病率高的地区(经济欠发达地区、下级乡镇等)进行普查是一项值得考虑的举措。3)做好医院感控工作，防止结核院内感染。目前我国各级医院经常出现人满为患的情况，应该做好做好医院感控工作，防止结核院内感染。保证候诊区的通风，及时发现、隔离疑似病例都是有效的手段。传统的结核确诊手段，需要考虑影像学、细菌学、临床表现、分子生物技术等许多方面，如：(1)询问病史和症状，体格检查。(2)胸片、CT等影像学检查。(3)痰涂片抗酸染色查抗酸杆菌。(4)痰培养找结核杆菌。近年发展起来的分枝杆菌快速培养、鉴定和药物敏感性检测技术使原来培养所需时间大大缩短。(5)结核菌素(现一般用PPD试验)。(6)抽血查结核抗体。(7)结核特异性反应T细胞的细胞因子释放试验如T-SPOT及QuantiFERON-TB检测方法，有助于鉴别结核分枝杆菌感染，区别于卡介苗接种和其他大多数非结核分枝杆菌感染。(8)结核杆菌聚合酶链反应(TB-PCR)+探针检查。近年开展的分枝杆菌基。因芯片检查技术、巢式PCR+反向点杂交分枝杆菌鉴定及耐药基因检测技术，使结核菌鉴定及药物敏感试验时间缩短到只需几个小时，为耐药结核病的及时合理治疗提供了方便。(9)纤维支气管镜检查，包经支气管镜活检、刷检，支气管肺泡灌洗或冲洗液获取标本进行细菌学、细胞学及病理学等检查。(10)临床标本的噬菌体分析方法。(11)经皮穿剌肺组织病理活检。(12)肺外淋巴结或其它器官的病理活检。比较上述诊断方法，虽然经典的PPD试验已经应用了100年，但是该方法灵敏度低，特异性差，不能鉴别卡介苗接种者，血清结核抗体检测等方法的灵敏度和特异性不理想；近几年兴起的γ干扰素释放试验的试剂昂贵，技术复杂，需要特殊的设备和培训，不适合基层医疗单位或者现场应用。结核菌素是结核分枝杆菌培养滤液蛋白，作用于人体会激发致敏机体产生IV型超敏反应，IV型超敏反应是由T淋巴细胞介到，通常在抗原攻击后48小时才能表现出来，其核心是CD4+和/或CD8+效应T细胞在识别靶抗原后造成的以淋巴细胞浸润为主要病理特征的炎症损伤。患过结核或者接种过卡介苗的人在皮下注射PPD24小时会出现炎性硬结，48-72小时达到高峰，有时会出现全身反应。通常反应强度与细胞免疫呈平行关系。PPD已经成为临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法，反应越强，表示结核感染可能性越大，我国一直使用硬结≥5mm为阳性，≥20mm或有水泡、坏死、淋巴结炎等为强阳性，3岁以下儿童≥15mm为强阳性的标准。用于结核病皮肤试验的主要试剂有以下几种：(1)旧结核菌素，不易标准化和易发生非特异性反应，已经被淘汰；(2)TB-PPD，人型结核菌素；(3)BCG-PPD，牛型结核菌素，是卡介苗培养液纯蛋白衍生物，主要用于卡介苗接种是否成功；(4)结核菌重组38kd蛋白，是一种新的皮试抗原，有结核感染者反应强，卡介苗接种者反应弱的特点。当前大规模人群筛查主要手段是PPD筛查。但是，PPD不能区分卡介苗(BCG)接种或是结核杆菌感染，假阳性的结果影响结核病筛查。因此，临床急需一种价格合适的，应用简便，无需特殊仪器，适合基层医疗单位的皮肤诊断试剂。安徽龙科马生物制药有限责任公司和海正药业分别在商品化试剂方面做出了尝试，龙科马公司将Esat-6与CFP-10融合表达，使得Esat-6与CFP-10在溶液中不能正确配对紧密结合；海正药业的专利技术将CFP-10与Esat-6融合表达存在同样的问题。本专利技术采用全新的策略，串联表达CFP-10，再向溶液中添加Esat-6单体，使其模拟天然组合物的搭配，从而提高抗原效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种结核分枝杆菌变态反应原组合物及其制备方法与应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种结核分枝杆菌CF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.结核分枝杆菌CFP10融合蛋白，其特征在于，所述CFP10融合蛋白是由n个如SEQ ID NO:3所示的结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3874的T细胞表位肽之间通过Linker串联得到的；其中，n是整数，n≥2；所述Linker是由5‑30个柔性氨基酸串联而成。

【技术特征摘要】
1.结核分枝杆菌CFP10融合蛋白，其特征在于，所述CFP10融合蛋白是由n个如SEQIDNO:3所示的结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3874的T细胞表位肽之间通过Linker串联得到的；其中，n是整数，n≥2；所述Linker是由5-30个柔性氨基酸串联而成。2.结核分枝杆菌Esat-6重组蛋白，其特征在于，所述Esat-6重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.结核分枝杆菌变态反应原组合物，其特征在于，所述组合物由权利要求1所述CFP10融合蛋白和权利要求2所述Esat-6重组蛋白按等重量比或等摩尔比混合而成。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述CFP10融合蛋白是由2个如SEQIDNO:3所示的结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3874的T细胞表位肽之间通过Linker串联得到的。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述CFP10融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。6.权利要求3-5任一项所述组合物在制备结核诊断...

【专利技术属性】
技术研发人员：高正伦，崔颖杰，王化楠，田家伦，
申请(专利权)人：北京祥瑞生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11