一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用。本发明专利技术将能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域融合于同一蛋白肽链形成双功能分子，采用真核细胞表达系统生产，表达产物结构单一，纯化工艺简便，蛋白产量高，制备工艺及产品稳定；与抗CD3和抗T细胞正共刺激分子全长抗体联用相比，所述双功能分子对T细胞的体外扩增效果更优，蛋白用量更少，且使用简便，可通过溶液形式直接添加，无需优化两种全长抗体的相对比例。

A bispecific molecule fused with anti CD3 antibody domain and T cell positive costimulatory ligand and its application

The invention belongs to the field of biological medicine technology, and specifically relates to a double specific molecule that combines the anti CD3 antibody domain and the T cell positive co stimulatory molecule ligand and its application. The invention will be able to combine and activate the first functional domain of the CD3 molecule on the surface of the T cell and the extracellular domain of the ligand of the positive co stimulator of the T cell to form a double functional molecule in the same protein peptide chain, and use the eukaryotic cell expression system to produce a single product structure, simple chemical technology, high protein production, and a preparation process. The product is stable. Compared with the combination of anti CD3 and T cell positive co stimulator, the two functional molecules have better in vitro amplification effect on T cells, less protein use, and easy to use, can be added directly through the solution form, without the need to optimize the phase pair ratio of two full-length antibodies.

【技术实现步骤摘要】
一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用。
技术介绍
T淋巴细胞(Tlymphocyte)来源于胸腺(Thymus)，故称T细胞。成熟T细胞存在于外周免疫器官的胸腺依赖区，在适应性细胞免疫应答中占据核心地位，同时在胸腺依赖性抗原诱导的体液免疫应答中亦发挥重要的辅助作用。根据功能的不同，T细胞可分为细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte,CTL)、辅助T细胞(HelperTcell,Th)和调节性T细胞(RegulatoryTcell，Treg)。其中CTL表达CD8，是适应性细胞免疫的主要效应细胞，其主要功能是特异性识别靶细胞表面的内源性抗原肽/MHCI类分子复合物，自身活化后可分泌穿孔素(Peforin)、颗粒酶(Granzyme)、颗粒溶素(Granulysin)等物质直接杀伤靶细胞(肿瘤细胞或寄生病原体感染的细胞)，也可通过Fas/FasL信号途径诱导靶细胞凋亡；而Th均表达CD4，通过分泌不同种类的细胞因子以及与其它细胞之间直接的相互作用，调节CTL的细胞活性，间接参与细胞免疫；此外，Treg可通过直接接触抑制靶细胞活化以及分泌IL-10、TGFβ等细胞因子对细胞免疫应答进行负调控，在免疫耐受、自身免疫病、感染性疾病及肿瘤等多种疾病中发挥重要的作用。CD8阳性T细胞的完全活化与高效扩增是其有效杀伤靶细胞的基础，依赖于双信号传递途径的作用：其中抗原递呈细胞(Antigenpresentingcell，APC)表面的MHCI/内源性抗原肽复合物特异性识别T细胞表达的TCR/CD3复合物，导致CD3与共受体CD8的胞质段相互作用，激活与胞质段尾部相连的蛋白质酪氨酸激酶，使CD3胞质区免疫受体酪氨酸激酶激活模体(Immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，ITAM)中的酪氨酸磷酸化，启动信号传导分子级联反应，激活转录因子，使得T细胞初步活化，这是T细胞活化的第一信号；同时，T细胞表面的共刺激分子(Co-stimulatorymolecule，例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40、GITR、CD27、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、BTLA等)可与APC细胞表面的共刺激分子配体(例如CD80、CD86、4-1BBL、B7RP-1、OX40L、GITRL、CD70、PD-L1、PD-L2、HVEM等)相互作用，产生T细胞活化的第二信号(共刺激信号)：其中CD28、4-1BB、ICOS、OX40、GITR和CD27等属于正共刺激分子，与相应配体(CD80、CD86、4-1BBL、B7RP-1、OX40L、GITRL、CD70等)相互作用所产生的第二信号(正共刺激信号)可导致T细胞的完全活化；而CTLA-4，PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT和BTLA等属于负共刺激分子，与相应配体(CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、Galectin-9、HVEM等)相互作用所产生的第二信号(负共刺激信号)主要是下调和终止T细胞的活化。目前针对T细胞活化的第一信号途径，已见报道通过基因工程设计并构建了一系列的抗CD3单克隆全长抗体(BeverleyPC等人,EurJImmunol,11:329-334,1981；LanzavecchiaA等人,EurJImmunol,17:105-111,1987；YannelliJR等人,JImmunolMethods,130:91-100,1990)。已有的实验数据表明，该类单克隆抗体能够特异性识别T细胞表面的CD3分子，产生T细胞活化的第一信号。然而，仅有第一信号传递途径非但不能有效激活T细胞，反而会导致T细胞失能甚至产生激活诱导的T细胞死亡(Activationinducedcelldeath，AICD)。为了克服CD3单克隆全长抗体的这一缺点，人们设计并构建了抗CD28、抗4-1BB以及抗ICOS等正共刺激分子的激活型单克隆全长抗体(USPatent20100168400A1；USpatent20100183621A1；USpatent009193789B2)，通过与抗CD3全长抗体联合使用，可以为T细胞提供完整的双信号活化途径。然而，两种单克隆全长抗体联合使用的方式在具体应用上仍存在一些不足，如明显增加了重组抗体表达与纯化的工作量与生产成本，实际应用于T细胞体外活化与扩增时必须优化两种全长抗体的相对比例。此外，两个全长抗体联合使用时，为促进受体细胞活化，需要添加较高浓度的抗体溶液或将抗体包被到培养板或微球上以增强其对受体细胞的活化效果。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种融合抗CD3抗体结构域和T细胞正共刺激分子配体的双特异性分子及其应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种双功能分子，其结构中包括能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和能够结合并激活T细胞正共刺激分子的第二功能域。优选地，所述双功能分子能够同时结合并激活T细胞表面CD3分子和T细胞正共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号。优选地，所述第一功能域为抗CD3的抗体，所述第二功能域为T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。优选地，所述抗体为小分子抗体。优选地，所述抗体选自Fab抗体、Fv抗体或单链抗体(scFv)。优选地，所述第一功能域和所述第二功能域通过连接片段连接。所述连接片段的氨基酸数量可为≥2个。优选地，所述连接片段选自以G4S为单位的连接片段或免疫球蛋白IgD的铰链区片段。所述G4S具体为GGGGS。所述以G4S为单位的连接片段包括一个或多个G4S单位。例如，可以包括是一个、二个、三个或四个以上的G4S单位。本专利技术的一些实施例中，列举了一单体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以G4S为单位的连接片段连接，所述连接片段含有三个G4S单位，所述连接片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段可以为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170。本专利技术的一些实施例中，列举了一二聚体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过免疫球蛋白IgD的铰链区片段连接，所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段为免疫球蛋白IgD的铰链Ala90-Val170，所述免疫球蛋白IgD的铰链区片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。所述连接片段可通过二硫键相互连接形成二聚体。优选地，所述第一功能域的C末端与所述第二结构域的N末端连接。优选地，所述第一功能域为抗CD3的单链抗体，所述抗CD3的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。优选地，所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.36所示。所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.37所示。本专利技术一些实施例中，列举了所述抗CD3的单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.35所示。优选地，所述T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域选自4-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双功能分子，其结构中包括能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和能够结合并激活T细胞正共刺激分子的第二功能域。

【技术特征摘要】
1.一种双功能分子，其结构中包括能够结合并激活T细胞表面CD3分子的第一功能域和能够结合并激活T细胞正共刺激分子的第二功能域。2.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述双功能分子能够同时结合并激活T细胞表面CD3分子和T细胞正共刺激分子，从而产生T细胞活化所需的第一信号和第二信号。3.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述第一功能域为抗CD3的抗体，所述第二功能域为T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。4.根据权利要求3所述的双功能分子，其特征在于，所述抗体选自Fab抗体、Fv抗体或单链抗体。5.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述第一功能域和所述第二功能域通过连接片段连接。6.根据权利要求5所述的双功能分子，其特征在于，所述连接片段选自以G4S为单位的连接片段或免疫球蛋白IgD的铰链区片段。7.根据权利要求6所述的双功能分子，其特征在于，以G4S为单位的连接片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；免疫球蛋白IgD的铰链区片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。8.根据权利要求1所述的双功能分子，其特征在于，所述第一功能域为抗CD3的单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述第二功能域为T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。9.根据权利要求8所述的双功能分子，其特征在于，所述抗CD3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.36所示；所述抗CD3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.37所示；所述T细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域选自4-1BBL胞外区结构域、B7RP-1胞外区结构域...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖远平，朱化星，陈帅，
申请(专利权)人：上海欣百诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31