葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽及其制备方法，它由三种Hrps多肽和葡聚糖通过共价修饰形成共价三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)n‑(C6H10O5)n；其中，三种Hrps多肽为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。通过葡聚糖修饰几个Hrps多肽组合片段，以共价复合的方式，将葡聚糖和几个Hrps功能多肽组合片段制备成完全和部分不完全共价三聚肽，即(3Hrps)n‑(C6H10O5)n共价三聚肽，使获得的Hrps‑葡聚糖新产品的乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，功能更多，应用范围更广。

Dextran modified Hrps covalent tripeptide and its preparation method

The present invention discloses a glucan modified Hrps covalent tripeptide and its preparation method. It is modified by covalent modification of three kinds of Hrps peptides and glucan to form covalent tripolypeptides. The general structural formula is: (3Hrps) n n (C6H10O5) n; among them, the Hrps polypeptide is SEQ ID NO:1, SEQ ID Any three of the amino acid sequences. Several Hrps polypeptide combination fragments were modified by dextran to prepare the complete and partial incomplete covalent tripolypeptides, namely (3Hrps) n n (C6H10O5) n trimer peptide, to make the emulsification stability, homogeneity and structure of the new Hrps Staphylococcus gluconate new product. It has higher stability, longer aging, more functions and wider application.

【技术实现步骤摘要】
葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽及其制备方法
本专利技术属于生物
，主要涉及葡聚糖修饰几个Hrps功能多肽组合片段的技术方法，以及通过该技术方法，将葡聚糖和几个Hrps功能多肽片段不同程度的共价复合，生成完全和部分不完全共价三聚肽，以及共价三聚肽产物在多领域的应用。
技术介绍
所有生物的细胞表面都由许多不同类型的糖链所包被,而且在细胞内也存在各种类型的糖基化。寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸以多种形式共价连接,构成糖蛋白的糖肽连接链。糖蛋白是参与许多生物过程的基本物质,这些过程包括细胞生长、细胞与细胞的粘着、免疫应答、受精、凝血块的降解、病毒增殖、寄生虫感染和炎症反应等。随着蛋白质组技术的不断发展,糖基化蛋白质组的研究将越来越受到广泛的重视。植物在长期进化中，在同周围各种生存和生长环境条件(包括生物的和非生物的)相互作用中，形成了一种共同的适应能力，这就是进化中形成的共同防御系统和生长系统，这是植物共有的一类防御机制和生长机制，并由多条信号通路和代谢途径来实现。研究表明，Hrp蛋白类作为植物的上游信号物质，与植物细胞壁中广泛存在的受体Hrp结合蛋白(Harpin-bindingproteins)结合并激活植物中的多条信号通路，这些信号通路的激活，将实现对植物固有的细胞防御和生长多条代谢途径和机制的启动和调控，这就是Hrp蛋白类作为植物生长调节剂和生物农药的作用机制。目前，称为超敏蛋白的Hrp蛋白类产品已被广泛研究、开发和应用，具有广阔的前景。随着基因工程技术的发展，越来越多的多肽、酶、信号分子、细胞因子等蛋白类制品被研究开发，这些蛋白类制品具有专一性强、时效高、应用广泛、安全性好等优点，但同时也发现了几个显著的不足之处，比如(1)可溶性和均一度较差；(2)抗原性及免疫原性；(3)容易从循环系统中被快速清除；(4)不稳定，容易被体内外的酶降解；(5)外用时，容易被外界环境的微生物快速降解和光降解。对于Hrps类蛋白来说，由于植物种类繁多，不同物种间、品种间生物学特性差异较大，内外环境也不同以及基因间互作的差异，不同来源和条件下获得的Hrps类蛋白及其制剂的性质在使用条件和效果上存在明显的选择性差异，单一种类的Hrps蛋白在功效上已经明显表现出不足；Hrps类蛋白作为应用于植物的一类上游功能性信号蛋白质，其可溶性和稳定性较差，同时，在自然条件下使用(叶面喷施和根施时)，很容易被外界环境的微生物快速降解和光降解，从而影响它们的时效和功效。鉴于以上原因，需要对Hrps类蛋白进行结构改造和化学修饰。结构改造和化学修饰法是指在分子水平上对蛋白质进行局部改造和修饰，即在体外将蛋白质的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的分子基团和大分子进行共价连接，形成完全和部分不完全的共价复合物，从而部分改变蛋白质的性质和结构，并显示出比各自独立存在时更优越的性能，该技术和方法已经在医药卫生和食品业的蛋白质产品的应用上引起越来越广泛的重视。需要强调指出的是，对不同来源的Hrps类蛋白多肽进行组合、结构改造和化学修饰形成共价复合物，国内外目前均未见报道。常见用于蛋白质修饰的分子基团和大分子很多，主要有聚乙二醇类(包括PEG和mPEG等)、多糖类，以及同源蛋白质及人工合成的多肽类、聚氨基酸等。对蛋白质的结构改造和化学修饰技术近几年来发展很快，针对不同的酶、多肽或蛋白质的化学修饰形成了多种技术和方法，但是，都有其适用范围和局限性，至今还没有普适的通用技术和方法可供选择和利用，随着蛋白质修饰技术研究的深入和发展，必将进一步促成能提高对各种不同蛋白质的修饰特异性好、修饰率高、操作简便、产物稳定性和功效性好的新技术和新方法的产生。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽及其制备方法，使Hrps多肽乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，功能更多，应用范围更广。本专利技术的技术方案为：葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，它由三种Hrps多肽和葡聚糖通过共价修饰形成共价三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)n-(C6H10O5)n；其中，三种Hrps多肽为SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。进一步地，SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4的质量配比为3:2:3:2。进一步地，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为10:1至1:10。进一步地，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为1:2。进一步地，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为5300-257200。进一步地，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为32000-38000。葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽的制备方法，制备步骤如下：(1)从SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入葡聚糖，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为：10:1至1:10；加入磷酸缓冲液，使体系pH值为2-10；静置0-5小时，在温度为15-80℃、搅拌速度为30-300r/min条件下反应3-25小时；(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得共价三聚肽，(3Hrps)n-(C6H10O5)n。进一步地，步骤(2)中，磷酸缓冲液的浓度为10-200mmol/L，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和葡聚糖总质量的10-100倍。优选地，制备方法如下：(1)从SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；其中，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4四种Hrps多肽的质量配比为3:2:3:2。(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入葡聚糖，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为32000-38000；三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为：1:2；加入浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和葡聚糖总质量的40倍，使体系pH值为7，静置1小时；在温度为46℃、搅拌速度为60r/min条件下反应12小时；(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得共价三聚肽，(3Hrps)n-(C6H10O5)n。四个Hrps功能多肽片段分别是:SEQNOID:1所示的Hrps多肽片段来源于由356个氨基酸组成的HrpsNEccs基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸157-356)。SEQNOID:2所示的Hrps多肽片段来源于由370个氨基酸组成的HrpsZpst基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由312个氨基酸组成，位于蛋白的N-端及C-端(氨基酸1-270和329-370)。SEQNOID:3所示的Hrps多肽片段来源于由370个氨基酸组成的HrpsNEcb基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸171-370)。SEQNOID:4所示的Hrps多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，它由三种Hrps多肽和葡聚糖通过共价修饰形成共价三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)n‑(C6H10O5)n；其中，三种Hrps多肽为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。

【技术特征摘要】
1.葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，它由三种Hrps多肽和葡聚糖通过共价修饰形成共价三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)n-(C6H10O5)n；其中，三种Hrps多肽为SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。2.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4的质量配比为3:2:3:2。3.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为10:1至1:10。4.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，三种Hrps多肽与葡聚糖的质量配比为1:2。5.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为5300-257200。6.根据权利要求1所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽，其特征在于，葡聚糖为燕麦β-葡聚糖，分子质量为32000-38000。7.根据权利要求1-6任一项所述的葡聚糖修饰的Hrps共价三聚肽的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)从SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入葡聚糖，三种Hrps多肽与葡聚糖的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伯骥，吴彦，
申请(专利权)人：四川本原作物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51