一种改良的人体液显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用方法技术

本发明专利技术涉及一种改良的人体液显色法真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖检测试剂盒，包括反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无菌水、标准品及质控品。反应主剂以东方鲎或美洲鲎血细胞裂解液为主要原料，含有G因子、B因子、C因子、凝固蛋白及多肽显色基质。所述反应主剂采用新的制备工艺，具有稳定性高和批间、批内差异小的特性；主剂复溶液采用新的配方，与反应主剂混合后，可有效的屏蔽鲎试剂内毒素反应支路。试剂盒使用酶标仪进行速率法酶动力学检测法，检测速度快，而且抗干扰性强，此外制备工艺简单、产品稳定性更强、特异性及灵敏度更高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用。
技术介绍
深部真菌感染又称侵袭性真菌感染(invasivefungalinfections，IFI)。在过去的二十年里，随着大量广谱抗生素的应用、骨髓器官移植的开展、抗肿瘤药物和糖皮质激素及免疫抑制剂的应用，导管介入治疗，特别是艾滋病的流行，象念珠菌血症和系统性曲霉菌病等深部真菌感染的发病率逐渐增多，而且深部真菌感染患者的病理特征不明显，其传统诊断方法假阴性率高、诊断周期长，现有快诊试剂的稳定性和重复性无法满足临床需求，不能及时的为临床提供准确的诊断依据，这些因素都造成了系统性真菌感染的诊断、预防和治疗非常困难，相对应的与这些感染相关的死亡率也非常高，这种状况日益引起医学界的重视。因此必须对深部真菌感染的诊治有了一定的认识，了解现有诊断方法的不足，开发出一种新的快速、准确、灵敏诊断方法或试剂，才能增加早期诊断的及时性和正确性，从而减少误诊率、漏诊率、死亡率。研究表明，1，3-β-D葡聚糖是除接合菌外，几乎所有的酵母和丝状真菌细胞壁中的组成成分。当真菌侵入人体血液或组织后，引起免疫应答反应，通过中性粒细胞和吞噬细胞的作用，人体体液中的1，3-β-D葡聚糖含量升高，在人体的定植真菌或浅部真菌感染中，均无此现象。因此，1，3-β-D-葡聚糖在血液及无菌体液中的含量成为国际公认的侵袭性真菌感染诊断标准。申请号为201210338802.4的中国专利技术专利“一种人体液真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒及其应用方法”中，公开了一种浊度法检测真菌(1，3)-β-D葡聚糖的试剂盒。然而，浊度法检测1，3-β-D葡聚糖在侵袭性真菌检测发展的二十年来被广泛应用，属于传统检测方法，此方法检测灵敏度较低，易受样本及药物引起的非特异性浊度干扰，引起假阳性或假阴性，检测准确度很难满足临床要求。公开日为2015年11月4日，申请号为105021817A的中国专利技术专利申请“一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒”公开了一种检测真菌1，3-β-D-葡聚糖的试剂盒。然而，其反应主剂制备方法为传统制备方法，无法消除由鲎血细胞内含物质的活性差异导致的试剂批间差异；其反应主剂中添加的B、C因子抑制剂可抑制G因子外的旁路反应，但与主剂复溶液混合后，在Mg2+参与下，其反应体系中主剂会失去对内毒素反应的抑制作用，影响试剂的稳定性和检测的准确性，很难满足临床要求。申请号为201420382343.4的中国技术专利“一种偶氮化终点显色法真菌葡聚糖检测试剂盒”中，公开了一种偶氮化终点显色法真菌葡聚糖检测试剂盒。在其使用时需样本处理、添加三种偶氮化试剂、添加终止剂，反应线路长，易受到人为操作干扰，影响检测的准确度，不易于未来的自动化应用。申请号为201420382432.9的中国技术专利“一种动态显色法真菌葡聚糖检测鲎试剂盒”中，公开了一种动态显色法真菌葡聚糖检测鲎试剂盒。其样本处理方式使用传统的加热稀释法，无法完全去除样本中的干扰因素，无法完全释放样本中的1，3-β-D-葡聚糖，并且使用加热稀释法处理后的样本与反应试剂混合后，使反应体系的液体粘度增加，易发生局部反应，影响检测结果。另外，其检测方法使用多肽显色基质作为反应指示物，增加了检测的灵敏度，但也同时放大了由于样本处理不彻底而产生的干扰信号，影响检测的准确度，很难满足临床要求。WO2001/052905A1公开了用于检测极小量β-1，3-葡聚糖的组合物，其制备方法以及检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒。本专利技术的组合物在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性，使用该组合物时，从样本收集样品，将该组合物和钙离子加入样品中，通过测定酚氧化酶而检测β-1，3-葡聚糖。然而，该方法精度不令人满意。“(1，3)-β-D-葡聚糖检测对深部真菌感染的诊断意义”，蒋伟等，实用预防医学，2014年1期，探讨血浆(1，3)-β-D-葡聚糖[(1，3)-β-D-Glucan，BDG]检测对深部真菌感染的诊断价值和方法，回顾性分析430例疑似病例的BDG结果及其临床特征，应用MB-80微生物动态快速检测系统及GKT25MSet动态真菌检测试剂盒定量检测血浆中BDG的含量，结合患者血液、痰或中段尿标本的真菌培养，用统计学方法计算BDG试验在真菌感染早期诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，同时连续检测血清BDG浓度变化，观察其与疾病进展和预后间的关系。然而，该方法操作比较复杂且检测准确度低。由上述现有技术可知，本领域需要一种兼具有工艺简单、稳定性高、灵敏度高、准确度高等多项优点的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术为提供一种生产工艺简单、设计合理、稳定性高、灵敏度高、准确度高，可匹配半自动、全自动检测分析仪开发和应用的一种改良的人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，包括：反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无菌水、标准品及质控品，反应主剂以东方鲎或美洲鲎血细胞裂解液为主要原料制得。优选地，所述反应主剂含有G因子、B因子、C因子、凝固蛋白及多肽显色基质。进一步的，所述反应主剂通过包括以下步骤的方法制得：(1)鲎细胞裂解物混批：将鲎细胞裂解液置于4℃环境，解冻8～14小时，将鲎细胞裂解物(例如至少2.5kg)混合，并在4℃环境下，充分搅拌5～30分钟；(2)鲎细胞裂解物乳化：将(1)中充分搅拌后的鲎细胞裂解物，在4℃环境下，使用匀浆机匀浆，匀浆机转速为5000rpm～18000rpm，匀浆时间控制在20分钟之内，使鲎细胞裂解物充分乳化，即得鲎细胞裂解物乳化液；(3)鲎细胞裂解液分装：将(2)中所得乳化液，在4℃温度下，以8000～12000rpm的速度离心15-30分钟，取上清液，分装备用，即为鲎细胞裂解液；(4)鲎细胞裂解液提纯：向(3)中鲎细胞裂解液中迅速加入20％-50％的氯仿(体积比，基于鲎细胞裂解液体积计)，在4℃环境下，充分搅拌1～5分钟，再在4℃温度下，以8000～12000rpm的速度离心15-30分钟，取上清液；(5)制剂：向步骤(4)所得上清液中添加多肽显色基质，每毫升上清液中含有0.3～1.0mg多肽显色基质；4℃环境下，充分搅拌5～15分钟，冷冻真空干燥，即得反应主剂。进一步的，所述主剂复溶液可以为0.05～1M的Tris-HCl缓冲液，其pH为7.0～8.0。进一步的，所述样本处理液可以为0.05～1.5M的KOH溶液和0.2～2.5M的KCl溶液的等体积混合溶液。进一步的，所述无菌水可以为注射用水或超纯水。进一步的，所述标准品制备方法可以为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品添加至含2-10％(质量比)赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇比例1∶3～9∶1(质量比)的混合物，充分搅拌5～30分钟，冷冻真空干燥。进一步的，所述质控品制备方法可以为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品和牛血清添加至含2-10％(质量比)赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇比例1∶3～9∶1(质量比)的混合物，充分搅拌5～30分钟，冷冻真空干燥本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良的人体液显色法真菌1，3‑β‑D‑葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无菌水、标准品和质控品；所述反应主剂以东方鲎或美洲鲎血细胞裂解液为主要原料制得。

【技术特征摘要】
1.一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无菌水、标准品和质控品；所述反应主剂以东方鲎或美洲鲎血细胞裂解液为主要原料制得。2.如权利要求1所述的试剂盒，所述反应主剂含有G因子、B因子、C因子、凝固蛋白和多肽显色基质。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述反应主剂通过包括以下步骤的方法制得：(1)鲎细胞裂解物混批：将鲎细胞裂解液置于4℃环境下，解冻8～14小时，将鲎细胞裂解物混合，并在4℃环境下，充分搅拌5～30分钟；(2)鲎细胞裂解物乳化：将(1)中充分搅拌后的鲎细胞裂解物，在4℃环境下，使用匀浆机匀浆，匀浆机转速为5000rpm～18000rpm，匀浆时间控制在20分钟之内，使鲎细胞裂解物充分乳化，即得鲎细胞裂解物乳化液；(3)鲎细胞裂解液分装：将(2)中所得乳化液在4℃温度下，以8000～12000rpm速度离心15-30分钟，取上清液，分装备用，即为鲎细胞裂解液；(4)鲎细胞裂解液提纯：向(3)中鲎细胞裂解液中迅速加入20％-50％(体积比)的氯仿，在4℃环境下，充分搅拌1～5分钟，然后再在4℃温度下，以8000～12000rpm离心15-30分钟，取上清液；(5)制剂：向步骤(4)所得上清液中添加多肽显色基质，每毫升上清液中含有0.3～1.0mg多肽显色基质；在4℃环境下，充分搅拌5～15...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：科赫生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11