一种识别CD19阳性肿瘤的嵌合抗原受体及细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种多靶点嵌合抗原受体，由主肽链和辅肽链组成，本发明专利技术的嵌合抗原受体可通过其CD19抗体的scFv结构域与靶细胞的CD19抗原结合，介导特异性的细胞杀伤；本发明专利技术的嵌合抗原受体可通过其IL‑15与IL‑15Rα‑sushi的复合体刺激T/NK细胞，使其免除对IL‑2的依赖并活化。本发明专利技术的嵌合抗原受体提供的胞外PD‑1结构域可以作为靶细胞表达的PD‑L1的特异性配体，一方面与T/NK细胞本身的PD‑1竞争性结合靶细胞表面的PD‑L1，另一方面此嵌合抗原受体的PD‑1与PD‑L1结合后信号传导给胞内的4‑1BBζ链，造成的结果不是T/NK细胞的抑制反而是激活，比单纯用PD‑1/PD‑L1抗体封闭抗原的方法更胜一筹。

A chimeric antigen receptor and cell for identifying CD19 positive tumors

The invention discloses a multi target chimeric antigen receptor, composed of a main peptide chain and a peptide chain. The chimeric antigen receptor of the invention can mediate specific cell killing by combining the scFv structure of the CD19 antibody with the CD19 antigen of the target cell; the chimeric antigen receptor of the invention can be recovered by the IL receptor 15 and the IL 15R alpha sushi. It stimulates T/NK cells to release and activate IL cells 2. The extracellular PD domain of the chimeric antigen receptor of the present invention can be used as a specific ligand for PD L1 expressed by the target cells, on the one hand, it is competitive with the PD 1 of the T/NK cell itself to combine the surface of the target cell on the surface of the target cell, and on the other hand, the PD binding 1 of the chimeric antigen receptor is connected to the PD L1 of L1, and the signal is transmitted to the 4 1BB zeta chain in the cell, The result is not inhibition of T/NK cells but activation, which is better than blocking antigen by PD 1/PD L1 antibody.

【技术实现步骤摘要】
一种识别CD19阳性肿瘤的嵌合抗原受体及细胞
本专利技术涉及生物
，尤其是一种识别CD19阳性肿瘤的嵌合抗原受体及细胞。
技术介绍
嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)是一种工程化的细胞表面受体，一般主要由抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域三部分组成，抗原结合域可结合靶细胞表面的抗原，经由跨膜结构域激活胞内信号传导结构域(专利号：CN105392888A)。表达嵌合抗原受体的免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)在胞内信号传导结构域的刺激下释放细胞因子诱导靶细胞凋亡，达到杀伤特定靶细胞的目的。B细胞恶性肿瘤是一种很常见的癌症，包括多种白血病和B细胞淋巴瘤。CD19是一个特异性表达在B细胞表面的蛋白，其他类型细胞都没有或很低水平表达，因此CD19成为一个非常理想的B细胞淋巴瘤标志抗原。研究者用CD19抗体作为抗原结合域构建CD19-CAR(CD19嵌合抗原受体)并将其表达在T细胞表面，借助CD19抗体的特异识别能力和T细胞的细胞杀伤能力，得到了特异杀伤B细胞淋巴瘤的CD19-CAR-T细胞。全球现在进行着大量的CD19-CAR-T的技术开发和临床研究，CD19-CAR-T在黑色素瘤、骨髓瘤和急/慢性淋巴细胞白血病等几乎所有实验都显示了极高的有效性(专利申请号：201480027401.4，201480027071.9，201510532222.2，201510061635.7)。PD-1(programmeddeath1)和它的受体PD-L1，PD-L2是T细胞活性的重要调节因子。T细胞表面的PD-1与其他细胞表面的PD-L1/2的结合造成T细胞的抑制，这在人体避免自体免疫病和产生免疫耐受的过程中起到重要作用，但一些病原微生物和癌细胞也能通过上调自身PD-L1/2或T细胞PD-1表达来逃避T细胞的监视，进而造成疾病。因此研究者探索用PD-1或PD-L1的抗体去结合抗原，以封闭这一信号通路，结果显示此方法能够显著提高T细胞活性，增强机体对病原微生物和癌症的抵抗能力，已有多项临床试验证明了PD-1/PD-L1抗体对于黑色素瘤、多发性骨髓瘤、白血病等癌症都有很好的治疗效果(专利申请号：200380109929.8，201310258289.2，201180019629.5)。T细胞或NK细胞的体外扩增都依赖IL-2的刺激，因此T细胞和NK细胞的培养基中都必须添加一定量的IL-2.为了简化NK细胞培养，并且鉴于IL-2在临床应用上的毒副作用，研究者对IL-2依赖的NK-92细胞做基因改造，使之稳定表达IL-2，发现可以免除培养基中IL-2的添加。IL-15与IL-2功能类似，而且共用相同的βγ受体，研究表示IL-2或IL-15对于NK细胞和CD8+T细胞的存活和增殖是必须的。于是研究者构建表达IL-15的NK细胞系，发现表达IL-15的NK-92细胞可以很大程度的减少培养基中IL-2的添加(专利号：03152968.2)。IL-15与IL-2虽然共用相同的βγ受体，但各自又有特异的α受体，研究发现IL-15Rα-sushi(IL-15受体α的sushi结构域)是IL-15的超级激动剂，可以极大的提高IL-15的功能(专利申请号：201280037114.2，201510358540.1)，IL-15与IL-15Rα-sushi的复合体可以完全替代IL-2在T/NK细胞中的作用，激活NK/CD8+T细胞并提高其杀伤肿瘤的细胞毒性。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术的目的是提供一种可以靶向CD19和PD-L1两个靶点，介导特异性的细胞杀伤的多靶点嵌合抗原受体；并通过其内部结构中的IL-15与IL-15Rα-sushi的复合体，可以刺激T/NK细胞，免除T/NK细胞对细胞因子的依赖性而扩增。本专利技术的技术方案是：一种多靶点嵌合抗原受体，由主肽链和辅肽链组成(图1)，所述主肽链包括抗原结合域A、辅肽链连接域B、跨膜结构域C和胞内信号传导结构域D；所述辅肽链包括抗原结合域E和主肽链连接域F；所述辅肽链连接域B和所述主肽链连接域F相互结合；所述抗原结合域A为antiCD19-ScFv；所述辅肽链连接域B为IL15Rαsushi所述跨膜结构域C为CD8的跨膜区；所述胞内信号传导结构域D为由CD3ζ信号传导区与4-1BB(CD137)信号传导区融合得到的多肽；所述抗原结合域E为PD1的胞外区；所述主肽链连接域F为IL15。进一步的，所述antiCD19-ScFv的氨基酸序列为序列1或与序列1具有75％以上同源性的多肽；进一步的，所述IL15Rαsushi的氨基酸序列为序列4；进一步的，所述CD8的跨膜区的氨基酸序列为序列5；进一步的，所述由4-1BB(CD137)与CD3ζ与融合得到的多肽的氨基酸序列由序列6和序列8组成；进一步的，所述PD1的胞外区的氨基酸序列为序列2；进一步的，所述主肽链连接域为IL15的氨基酸序列为序列3。进一步的，所述多靶点嵌合抗原受体的主肽链的氨基酸序列为序列9；且所述受体的辅肽链的氨基酸序列为序列10。进一步的，由编码所述主肽链的核酸分子或编码所述辅肽链的核酸分子组成。进一步的，含有所述的核酸分子的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞。进一步的，所述细胞为原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞；或，所述哺乳动物细胞具体为人类细胞；或，所述人类细胞具体为免疫细胞，或，所述免疫细胞具体为T细胞或NK细胞。进一步的，所述的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞在免疫治疗中的应用；或，在免疫细胞培养与增殖中的应用；或，在免疫检测中的应用。或，在制备免疫治疗产品中的应用；或，在制备免疫细胞培养与增殖产品中的应用；或，在制备免疫检测产品中的应用；或，在抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞中的应用；或，在制备抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞产品中的应用；一种试剂盒，包括所述的多靶点嵌合抗原受体、所述的核酸分子或所述的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞。进一步的，所述的试剂盒在免疫治疗中的应用；或，在免疫细胞培养与增殖中的应用；或，在免疫检测中的应用。或，在制备免疫治疗产品中的应用；或，在制备免疫细胞培养与增殖产品中的应用；或，在制备免疫检测产品中的应用；或，在抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞中的应用；或，在制备抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞产品中的应用与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的嵌合抗原受体可通过其CD19抗体的scFv结构域与靶细胞的CD19抗原结合，介导特异性的细胞杀伤；本专利技术的嵌合抗原受体可通过其IL-15与IL-15Rα-sushi的复合体刺激T/NK细胞，使其免除对IL-2的依赖并活化。本专利技术的嵌合抗原受体提供的胞外PD-1结构域可以作为靶细胞表达的PD-L1的特异性配体，一方面与T/NK细胞本身的PD-1竞争性结合靶细胞表面的PD-L1，另一方面此嵌合抗原受体的PD-1与PD-L1结合后信号传导给胞内的4-1BBζ链，造成的结果不是T/NK细胞的抑制反而是激活，比单纯用PD-1/PD-L1抗体封闭抗原的方法更胜一筹。附图说明图1为多靶点嵌合抗原受体示意图。多靶点嵌合抗原受体由主肽链和辅肽链组成；主肽链包括抗原结合域A、辅肽链连接域B、跨膜结构域C和胞内信号传导本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多靶点嵌合抗原受体，由主肽链和辅肽链组成，其特征在于，所述主肽链包括抗原结合域A、辅肽链连接域B、跨膜结构域C和胞内信号传导结构域D；所述辅肽链包括抗原结合域E和主肽链连接域F；所述辅肽链连接域B和所述主肽链连接域F相互结合；所述抗原结合域A为识别CD19的抗体；所述辅肽链连接域B为IL15Rαsushi所述跨膜结构域C为CD8的跨膜区；所述胞内信号传导结构域D为由CD3ζ信号传导区与4‑1BB(CD137)信号传导区融合得到的多肽；所述抗原结合域E为PD1的胞外区；所述主肽链连接域F为IL15。

【技术特征摘要】
1.一种多靶点嵌合抗原受体，由主肽链和辅肽链组成，其特征在于，所述主肽链包括抗原结合域A、辅肽链连接域B、跨膜结构域C和胞内信号传导结构域D；所述辅肽链包括抗原结合域E和主肽链连接域F；所述辅肽链连接域B和所述主肽链连接域F相互结合；所述抗原结合域A为识别CD19的抗体；所述辅肽链连接域B为IL15Rαsushi所述跨膜结构域C为CD8的跨膜区；所述胞内信号传导结构域D为由CD3ζ信号传导区与4-1BB(CD137)信号传导区融合得到的多肽；所述抗原结合域E为PD1的胞外区；所述主肽链连接域F为IL15。2.根据权利要求1所述的多靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述识别CD19的抗体antiCD19-ScFv的氨基酸序列为序列1，或与序列1具有75％以上同源性的多肽；所述IL15Rαsushi的氨基酸序列为序列4；所述CD8的跨膜区的氨基酸序列为序列5；所述由4-1BB(CD137)与CD3ζ与融合得到的多肽的氨基酸序列由序列6和序列8组成；所述PD1的胞外区的氨基酸序列为序列2；所述主肽链连接域为IL15的氨基酸序列为序列3。3.根据权利要求1或2所述的多靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述多靶点嵌合抗原受体的主肽链的氨基酸序列为序列9；且所述受体的辅肽链的氨基酸序列为序列10。4.权利要求1-3中任一所述的多靶点嵌合抗原受体的编码核酸分子，由编码所述主肽链的核酸分子或编码所述辅肽链的核酸分子组成。5.含有权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，高斌，吴亚松，司远，吕丹，魏卿，
申请(专利权)人：天津天锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12