一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法技术

本发明专利技术公开一种提高结核菌素BCG‑PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，采用吐温对BCG‑PPD原液进行分散，分散所用的吐温的体积为BCG‑PPD原液体积的0.8％～6％。本发明专利技术还提供了一种含有结核分枝杆菌疫苗BCG组分的PPD体内诊断试剂的制备方法。本发明专利技术的试剂组合对结核病的检测灵敏度高，具有良好的物理和化学稳定性，具有广阔的市场前景和应用价值。采用本发明专利技术所述方法生产的结核菌素BCG‑PPD皮试诊断试剂，效期可以提高到36个月。

A Method to Improve the Stability of BCG-PPD Skin Test Diagnostic Reagent for Tuberculin

The invention discloses a method for improving the stability of tuberculin BCG PPD skin test diagnostic reagent. Tween is used to disperse BCG PPD raw liquor, and the volume of Tween used for dispersing is 0.8%~6% of the volume of BCG PPD raw liquor. The invention also provides a preparation method of in vivo diagnostic reagent for PPD containing BCG component of Mycobacterium tuberculosis vaccine. The reagent combination of the invention has high sensitivity for tuberculosis detection, good physical and chemical stability, and broad market prospect and application value. The skin test diagnostic reagent of tuberculin BCG PPD produced by the method described in the present invention has a validity period of 36 months.

【技术实现步骤摘要】
一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法
本专利技术属于生物
，具体是涉及一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法。技术背景结核病是危害人类健康的主要传染病之一，结核病是一种由结核分枝杆菌造成的、严重的细菌传染病，通常影响肺部。此病通过活动性呼吸道疾病患者咽喉和肺部产生的飞沫在人际传播。在健康人身上，结核分枝杆菌感染通常不引发症状，因为其免疫系统会发挥作用阻挡细菌。活动性肺结核的症状是咳嗽,有时有痰或血，胸痛，虚弱、体重减轻，发烧和盗汗。结核病可以通过六个月抗生素疗程得到治疗。结核病是全球第九大死因，也是因单一病原体造成的主要死因，高于艾滋病毒/艾滋病。据估计，2016年，在艾滋病毒阴性者中，130万人死于结核病(低于2000年的170万人)，在艾滋病毒阳性者中，37.4万人死于结核病。2016年，据估计，全球结核病新发病例数为1040万例，其中成人占90％，男性占65％，艾滋病毒携带者占10％(74％在非洲)，印度、印度尼西亚、中国、菲律宾和巴基斯坦等5个国家的新发病例占56％。持续面临耐药结核病威胁。2016年，新增60万例利福平耐药结核病，其中49万例是耐多药结核病。这些病例的几乎一半发生在印度、中国和俄罗斯。在全球范围内，结核病死亡率每年下降约3％，发病率每年下降约2％，16％的结核病患者死于该病。到2020年，这些数据必须每年分别下降4％-5％和10％，这样才能达到终止结核病战略确定的2020年第一个里程碑。早期诊断和适当治疗可避免大多数的结核病死亡病例。每年有数以百万计的人得救，他们被诊断出结核病并获得成功治疗(2000-2016年间共挽救了5300万人生命)。尽管如此，在检测和治疗方面仍存在很大差距。2016年报告的结核病新发病例数为630万例(高于2015年的610万)，相当于1040万例估计发病数的61％。最新治疗结果数据显示，全球结核病治疗成功率为83％，与近年水平相似。艾滋病毒阳性者的结核病例报告数为476774例(占估测发病数的46％)，其中85％患者正在接受抗逆转录病毒治疗。共有129689人开始接受耐药结核病治疗，略高于2015年的125629人，但仅为估测发病人数的22％，且治疗成功率仍较低，在全球为54％。为大幅度缩小这些差距，必须在一组结核病高负担国家中取得更大进展。在结核病新发病例数与报告病例数之间仍存在缺口，10个国家占缺额的76％，居于前3位的国家分别是印度、印度尼西亚和尼日利亚。在耐药结核病发病率与治疗病例数之间存在的缺口上，10个国家占了75％，印度和中国共占39％。在与艾滋病相关结核病的缺口上，世卫组织非洲区域占一半以上。2016年各国结核病新发病例数与人口总数比例相差很大。大多数高收入国家每10万人口结核病新发病例低于10例，在30个结核病高负担国家中，大多数国家每10万人口结核病新发病例在150-300例之间，少数几个国家每10万人口超过500例。结核传染病的严重程度与引起结核病的结核分枝杆菌持续无症状感染能力有关。近一个世纪以来，结核菌素皮试试验被应用于鉴别感染结核分枝杆菌的人。早在1890年RobertKoch提出结核杆菌甘油提取物能够治愈和预防结核病。虽然Koch的旧结核菌素(OT)作为治疗剂最终失败，他的发现促使现代皮试试剂(TST)的开发，TST是迄今为止鉴别潜在的结核病例最重要的工具。TST试验也被称为芒图试验，名字来源于法国医生CharlesMantoux(1877–1947)，他建立了读取TST的诊断标准。由美国胸科协会和美国疾控中心支持的芒图试验是现行的用于确认个体感染结核菌的金标准。该免疫试验由两部分构成。第一部分将结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试剂皮内注射于前臂；第二部分是测量注射部位硬结(炎性红肿)直径的毫米数监测注射后48至72小时引起的迟发型过敏反应(Delayed-typehypersensitivity)。通常PPD注射24小时以内出现可见的红疹，由于不能指示感染状态，无须测量。解读芒图试验结果的操作必须有经过训练的专业人员完成，他们能够依据测量的阳性反应程度解释感染的风险因素。TST除了用作结核分枝杆菌感染指示剂，还可用于流行病学调查工具评估结核菌潜伏感染流行情况。全球三分之一人口感染结核菌的推测部分基于TST阳性的频率。首次结核菌素皮试试验在1907年由VonPirquet(1874–1929)引入，他是奥地利科学家和儿科医师。在他的研究中，使用了Koch的旧结核菌素，旧结核菌素是一种加热的细菌培养物，由结核杆菌的蛋白质和其他大分子物质构成，是未经纯化的、组分不清的混合粗提物。旧结核菌素制备过程是通过浓缩过滤结核分枝杆菌生长6-8周的甘油蛋白胨培养基而成。旧结核菌素和类似产品因为未纯化，效价和特异性波动，以及未充分标化，而没有在美国用作TST试剂。1930年生产了一种叫MA-100的无多糖配方试剂，由结核分枝杆菌培养物滤液制备而成。MA-100比OT具有更高的效价，然而MA-100的应用受到局限，主要由于重复注射在皮内观察到致敏效应。1934年一个更稳定的、均一的试剂由美国宾夕法尼亚大学生物化学家FlorenceB.Seibert(1897–1991)开发出来。最初以生产方式命名为SOTT，SOTT首字母来自syntheticmediumoldtuberculintrichloroaceticacidprecipitate。该产品后来被命名为纯化蛋白衍生物或者PPD。它是在阿诺德灭菌器里蒸汽处理结核菌培养物，然后硫酸铵多次沉淀纯化蛋白质。与以前的结核菌素试剂比较，PPD制备方法显著地减少多糖、核酸和脂类成分，得到富含蛋白质的试剂。1944年，大批量的改进PPD(lot49608)重新命名为PPD-S(PPD-Standard)，被提供作为美国参考品。PPD-S含有大约92.9％蛋白，5.9％多糖和1.2％核酸。因为高效价和高纯度，1952年PPD-S被WHO采纳为结核菌素国际标准品。从1978开始，美国FDA规定所有批次的PPD都要通过生物化学方法检定，必须与PPD-S效价一致。PPD国际单位IU被定义为效价单位，1个IU等于0.028μgPPD-S的生物学活性(0.02μgPPD和0.008μg盐)。然而，在美国和加拿大，PPD效价被表述为结核菌素单位TU而不是IU。1个TU被定义为0.02μgPPD-S。5个TU是基于流行病学研究的标准皮内诊断使用剂量。PPD-S2是现行的美国PPD结核菌素标准品，预期最终取代PPD-S(Villarino,etal.,2000)。当前，和是两个广泛应用的、商业化的、以PPD-S2为标准的产品，皮试结果与最初的PPD-S标准一致。然而相互转换使用和皮试结果出现偏差，确切原因尚不清楚。除了PPD-S，还有其他几种PPD配方在美国和加拿大以外的国家使用,这些产品中的几个包括PPDRT23是由丹麦血清所生产。当前，WHO和IUATLD推荐2TU含有吐温80的PPD-RT23。RT23是全球使用最广泛的产品。全世界有几项研究使用了PPDRT23评估结核分枝杆菌感染流行水平，包括印度、加纳、也门、南非、尼泊尔、巴西、印度尼西亚。此外也被用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高结核菌素BCG‑PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，其特征在于，采用吐温对BCG‑PPD原液进行分散，分散所用的吐温的体积为BCG‑PPD原液体积的0.8％～6％。

【技术特征摘要】
1.一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，其特征在于，采用吐温对BCG-PPD原液进行分散，分散所用的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的0.8％～6％。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的1％～5％，优选为3％～5％；所述吐温选自吐温20、吐温60或吐温80，优选为吐温80。3.一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，其特征在于，采用吐温对BCG-PPD原液分散后进行稀释和分装，稀释和分散后的溶液中，吐温的最终体积含量为0.0005％-0.005％，优选为0.001％-0.005％，更优选为0.002％-0.003％，最优选为0.0025％。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，分散所用的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的0.8％～6％。5.权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述BCG-PPD原液的制备方法包括菌培、灭活和沉淀；所述菌培具体工艺为：工作种子菌种首先培养发育为干皱成团呈浅黄色的菌苔，菌苔镜检状态为短粗杆菌，微弯曲两端圆；然后再进行2代培养至多皱、微黄色的菌膜，待菌膜铺满培养基表面、培养液澄清透明时传代进行3代培养，3代培养至形成多皱微黄的菌膜后进行4代培养8-10周。6.权利要求5任一项所述的方法，其特征在于，所述菌培方法具体为：工作种子菌种1代培养2～...

【专利技术属性】
技术研发人员：高正伦，党银慧，王翠芳，
申请(专利权)人：北京祥瑞生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11