本公开涉及一种标记外泌体的方法和AIE荧光分子标记的外泌体及其应用，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记。本公开利用特定的聚集诱导发光荧光分子稳定高效地对外泌体进行标记，不改变外泌体的结构和组成成分，不影响其生物功能，所得到的标记后的外泌体可用于制备示踪药物，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。
Methods of labeling exosomes and AIE fluorescent molecular labeling exosomes and their applications
The present disclosure relates to a method for labeling exosomes and exosomes labeled with AIE fluorescent molecules and their applications. The method includes mixing a labeling solution containing AIE fluorescent molecules with exosomes for fluorescent labeling. The present disclosure uses specific aggregation-induced fluorescent molecules to label exosomes stably and efficiently, without changing the structure and composition of exosomes and affecting their biological functions. The labeled exosomes obtained can be used to prepare tracer drugs and contribute to the further study of the function of exosomes.
【技术实现步骤摘要】
标记外泌体的方法和AIE荧光分子标记的外泌体及其应用
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种标记外泌体的方法和AIE荧光分子标记的外泌体及其应用。
技术介绍
外泌体是由活细胞分泌的直径约30-100nm的具有双层膜结构的纳米级细胞外囊泡，天然存在于血液、唾液、尿液和母液等各种体液中。外泌体作为细胞外囊泡的重要组成部分，已成为细胞间通讯的重要形式，其所介导的细胞间通讯可以为邻近细胞提供大量的生物活性信号分子，包括DNA、RNA、microRNA及蛋白质等。被释放至细胞外的外泌体可以通过不同的途径进入靶细胞内，发挥其生物学功能。第一，外泌体可以通过与靶细胞膜表面受体结合，触发靶细胞内的信号转导通路，并进一步调节靶细胞内的生物学过程；第二，外泌体可以被靶细胞内在化，这一过程依赖于网格蛋白介导的内吞作用、脂筏介导的内吞作用及胞饮作用等；第三，外泌体可以通过与靶细胞膜融合，直接将外泌体内携带的活性物质递送到靶细胞内。随着细胞生物学和医学前沿交叉领域的不断发展，外泌体的研究逐渐深入，越来越多的研究证明外泌体在疾病治疗中展现出令人振奋的治疗效果。如间充质干细胞来源的外泌体通常被认为具有与间充质干细胞相似的功能，包括促进组织损伤修复、抑制炎症反应及减轻组织纤维化程度等。但是，在利用外泌体进行治疗前，首先要阐明外泌体在体内的生物分布和在细胞中的最终命运。所以迫切需要一种标记方法实现对外泌体的体外标记和活体示踪，从而实现在不影响其功能的前提下可视化外泌体，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前为止已有多种标记外泌体的方法，但是都存在一定的缺陷，主要表现在破坏外泌体的膜结构、改变外泌体的组成成分、影响外泌体的功能。例如荧光蛋白报告系统和荧光素酶报告系统通过构建CD63或Gluc过表达的稳定细胞系而产生具有CD63-GFP或Gluc-GFP标记的外泌体，所以这些细胞产生的外泌体的组成成分已经发生改变，而且CD63在外泌体的生物发生和功能中是一种重要的蛋白，也影响了外泌体的功能。通过修饰外泌体的结构、利用外泌体表面的巯基和通过放射性核素标记外泌体则破坏或改变了外泌体的膜结构，改变了其物理性质从而影响外泌体的功能。而最常用的各种荧光染料，却具有很高的淬灭系数，导致其半衰期短且易淬灭，而且它们可以在与外泌体相似的水溶液中形成染料聚集体，导致在外泌体的摄取实验中带来误差。
技术实现思路
本公开的目的是提供一种标记外泌体的方法和AIE荧光分子标记的外泌体及其应用，该方法不改变外泌体的结构和组成成分，也不影响外泌体的生物功能。为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种标记外泌体的方法，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记，其中，所述AIE荧光分子的结构式为：可选地，以含有100μg蛋白质的外泌体为基准，所述AIE荧光分子的用量为1～8nmol。可选地，所述标记溶液为AIE荧光分子与缓冲液的混合物，所述AIE荧光分子的终浓度为1～8μmol/L。可选地，所述缓冲液为PBS、Na-HEPES、HEPES或生理盐水。可选地，所述荧光标记的条件为：温度为4～37℃，时间为2～3h。可选地，所述外泌体为来源于干细胞的外泌体，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞和心脏干细胞中的一种或多种。可选地，该方法还包括将荧光标记后的物料进行离心分离的步骤，所述离心的条件为：速度为100000～130000rcf，时间为60～120min。本公开第二方面：提供由本公开第一方面所述的方法得到的AIE荧光分子标记的外泌体。本公开第三方面：提供本公开第二方面所述的AIE荧光分子标记的外泌体在制备示踪药物中的用途。通过上述技术方案，本公开利用特定的聚集诱导发光荧光分子稳定高效地对外泌体进行标记，不改变外泌体的结构和组成成分，不影响其生物功能，所得到的标记后的外泌体可用于制备示踪药物，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：图1是测试实施例1的外泌体透射电子显微镜照片；图2是测试实施例2的外泌体标志蛋白的Westernblot鉴定结果；图3是测试实施例3的外泌体的粒径和Zeta电位的纳米颗粒跟踪分析结果；左图中，横坐标代表直径，纵坐标代表浓度；右图中，横坐标代表Zeta电位，纵坐标代表频率；图4是测试实施例4的AIE荧光分子标记的外泌体的标记率和稳定率结果；图5是测试实施例5的AIE荧光分子标记的外泌体的内化结果，左图为AIE荧光分子标记的外泌体，中间为细胞核，右图为AIE荧光分子标记的外泌体被内化于细胞核和细胞质；图6是测试实施例5的AIE荧光分子标记的外泌体和DiI标记的外泌体在1天和5天时被细胞内化后荧光信号的比较结果；图7是测试实施例6的AIE荧光分子标记的外泌体在不同时间点的体内示踪结果；图8是测试实施例7的不同浓度的AIE荧光分子标记的外泌体对细胞活力的影响结果，横坐标代表AIE荧光分子浓度，纵坐标代表细胞活力；图9是测试实施例7的外泌体对损伤组织的修复情况。图10是对比例中荧光分子对细胞的标记情况。其中，Exos代表未标记的外泌体，AIE-Exos代表AIE荧光分子标记的外泌体，DiI-Exos代表DiI荧光分子标记的外泌体，Con代表对照组。具体实施方式以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开第一方面：提供一种标记外泌体的方法，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记，其中，所述AIE荧光分子的结构式为：根据本公开，所述AIE荧光分子可以采用现有技术中的方法制备得到，例如参照：YuCYY,XuH,JiS,etal.Radiosensitizers:Mitochondrion-AnchoringPhotosensitizerwithAggregation-InducedEmissionCharacteristicsSynergisticallyBooststheRadiosensitivityofCancerCellstoIonizingRadiation(Adv.Mater.15/2017)[J].AdvancedMaterials,2017,29(15):1606167.中的方法制备得到。根据本公开，所述外泌体可以为来源于干细胞的外泌体。进一步地，所述干细胞可以包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞和心脏干细胞中的一种或多种。本公开对获得所述外泌体的方式没有特殊的限制，例如可以采用现有技术中的方法提取得到所述外泌体。根据本公开，以含有100μg蛋白质的外泌体为基准，所述AIE荧光分子的用量可以为1～8nmol，优选为4nmol。根据本公开，所述标记溶液为AIE荧光分子与缓冲液的混合物，所述AIE荧光分子的终浓度可以为1～8μmol/L，优选为4μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种标记外泌体的方法，其特征在于，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记，其中，所述AIE荧光分子的结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种标记外泌体的方法，其特征在于，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记，其中，所述AIE荧光分子的结构式为：2.根据权利要求1所述的方法，其中，以含有100μg蛋白质的外泌体为基准，所述AIE荧光分子的用量为1～8nmol。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标记溶液为AIE荧光分子与缓冲液的混合物，所述AIE荧光分子的终浓度为1～8μmol/L。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述缓冲液为PBS、Na-HEPES、HEPES或生理盐水。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述荧光标记的条件为：温度为...
【专利技术属性】
技术研发人员：王悦冰，曹红梅，岳志伟，丁丹，李宗金，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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