一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法技术

一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，属于生物医学技术领域，1)制备具有靶向效果的纳米粒子；2)细胞摄取具有靶向效果的纳米粒子；3)通过荧光共定位观测量子点在细胞内的分布情况；4)通过MTT方法测定细胞毒性。本发明专利技术的一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，可以有效地帮助纳米物质在进入细胞后，从囊泡中逃逸出来，进而进入其靶向的细胞器位置，并且对细胞产生的毒性几乎可忽略不计。

A Method for Improving the Targeted Transport of Nanoscale Substances in Living Cells

A method to improve the targeting effect of nano-scale substances in living cells belongs to the field of biomedical technology. 1) preparation of nanoparticles with targeting effect; 2) uptake of nanoparticles with targeting effect by cells; 3) observation of quantum dots distribution in cells by co-localization of fluorescence; 4) determination of cytotoxicity by MTT method. A method of improving the targeting delivery effect of nano-level substances in living cells can effectively help nano-materials escape from vesicles after entering cells and then enter the target organelles, and the toxicity to cells can be neglected.

【技术实现步骤摘要】
一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法。
技术介绍
在生物医学领域，纳米材料(如碳纳米管、硅纳米线、金纳米颗粒、量子点等)已广泛应用；另外各种生物大分子(蛋白质、SiRNA等)也属于纳米级别物质，也广泛应用于生物医学领域。这些纳米级别物质针对细胞表面的靶向标记技术相对较容易，但是活细胞内部的靶向递送是一个难题。这是因为，为了达到活细胞内靶向递送(例如定点送到某特定细胞器)的目的，纳米物质需要跨越多个传输屏障。当纳米物质通过通常的内吞途径被细胞摄取进入细胞内之后，会被困在囊泡中很难逃逸出来(一般逃出比例小于1％)，在这种情况下，虽然纳米物质表面有靶向生物分子，也很难到达靶向目的地。现有技术中，用来帮助纳米物质从囊泡逃脱的方法通常效率不佳或者对细胞的毒性大，或两个缺陷兼有。
技术实现思路
专利技术目的：为解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，有效地帮助纳米物质在进入细胞后，从囊泡中逃逸出来，进而进入其靶向的细胞器位置。技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，包括如下步骤：1)制备具有靶向效果的纳米粒子将纳米粒子量子点表面连上穿膜肽，得到具有靶向效果的纳米粒子；2)细胞摄取具有靶向效果的纳米粒子向培养液中滴加入助溶剂，将修饰过的量子点分散到助溶剂的培养液中，滴加到细胞培养皿中，放入细胞培养箱中进行共培养；3)通过荧光共定位观测量子点在细胞内的分布情况经过与细胞在培养箱中共培养后，在激光共聚焦显微镜下观察；采用细胞核染料对细胞核进行染色，采用对细胞膜和内含体进行染色，共定位细胞器与量子点的相对位置；通过荧光共定位测定来测试量子点纳米粒子在活细胞内从囊泡逃脱的比例、靶向输送到细胞核的比例；4)通过MTT方法测定细胞毒性。所述的具有靶向效果的纳米粒子的粒径在8～12nm。步骤2)中，所述的助溶剂选自DMSO，DMF，乙醇，丙酮或者四氢呋喃中任意一种或者几种的组合。步骤2)中，滴加完毕所述的助溶剂后，所述的助溶剂在培养液中的体积浓度为1％。步骤2)中，所述的共培养条件为：标准的细胞培养环境为37℃，浓度为5％的CO2。步骤3)中，所述的对细胞核进行染色的染料为Hoechst33342，所述的对细胞膜和内含体进行染色的染料为DiO。专利技术原理：首次提出并证实可以用小比例的助溶剂高效且无毒(或低毒)地提高纳米级别物质(此处用荧光量子点作为模型纳米级别物质)穿越活细胞内传输屏障并达到活细胞内靶向传输的作用。细胞膜内陷形成的囊泡，将纳米粒子包裹在囊泡中，细胞通过胞吞作用将包含有纳米粒子的囊泡运送至活细胞内。但是，在正常的生物环境下，这一囊泡结构可以很稳定地存在于活细胞内，囊泡里的纳米粒子也就很难从中逃逸出来。并且在肌动蛋白的作用下，这些囊泡沿着微管运动，最终被输送至细胞核外区域(MTOC)，在那里聚集而无法进入细胞核内。这一结果导致纳米粒子无法在活细胞内实现其功能。而助溶剂的存在可以起到撬动细胞膜(磷脂双分子层)结构的作用，使得磷脂双分子层变得松动，增强了细胞膜的通透性。因为囊泡是由于细胞膜内陷形成的，即囊泡膜结构与细胞膜结构是一致的。因此当助溶剂渗透至细胞内的时，也会使得囊泡结构发生松动。同时经一些研究发现助溶剂，例如DMSO，也可以帮助提高TAT穿膜肽的穿膜能力。因此，助溶剂的存在可以较好地帮助TAT-QD从囊泡中逃逸出来，从而运动至其靶向的细胞器——细胞核处。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，可以有效地帮助纳米物质在进入细胞后，从囊泡中逃逸出来，进而进入其靶向的细胞器位置，并且对细胞产生的毒性几乎可忽略不计。附图说明图1为助溶剂提高纳米粒子靶向效果的示意图；图2为助溶剂DMSO(体积浓度为1％)帮助纳米粒子从囊泡中逃逸出来；图3为助溶剂DMSO(体积浓度为1％)成功提高了纳米粒子靶向效果；图4为不同类型助溶剂都能有效提高纳米粒子靶向效果的示意图；图5为助溶剂成功在不同类型细胞中都能帮助提高纳米粒子的靶向效果；图6为助溶剂的细胞毒性非常小；图7用助溶剂提高TAT-QD在活细胞内定点输送抗癌药物。具体实施方式为了进一步说明本专利技术，以下结合实例及附图对本专利技术提供的技术方法做进一步详细的描述。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外，应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述部分词语说明：量子点(QD)购于OceanNanoTech(美国)。DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素(Penicillin)、链霉素(Streptomycin)、胰蛋白酶(Trypsin)购于Gibco(美国)。DiO、Hoechst33342购于LifeTechnologies(美国)。在这项工作中所使用的其它试剂购于国药(集团)化学试剂公司。一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，包括如下步骤：1、制备具有靶向效果的纳米粒子将纳米粒子量子点(发荧光容易被荧光显微镜观测，此处作为纳米物质的模型)表面连上穿膜肽(TAT)(识别细胞核的生物靶向分子)，其粒径在8～12nm。2、细胞摄取具有靶向效果的纳米粒子将培养液中滴加入助溶剂(DMSO，DMF，乙醇，丙酮或者四氢呋喃)，最终助溶剂在培养液中的体积浓度为1％。将修饰过的量子点分散到含体积浓度为1％助溶剂的培养液中，滴加到细胞培养皿中，放入细胞培养箱中进行共培养(标准的细胞培养环境为37℃，浓度为5％的CO2)。3、通过荧光共定位观测量子点在细胞内的分布情况经过与细胞在培养箱中共培养到指定的时间后，在激光共聚焦显微镜下观察。为了共定位细胞器与量子点的相对位置，我们采用细胞核染料Hoechst33342对细胞核进行染色，采用DiO对细胞膜和内含体进行染色。通过荧光共定位测定来测试量子点纳米粒子在活细胞内从囊泡逃脱的比例、靶向输送到细胞核的比例。4、通过MTT方法测定细胞毒性。助溶剂提高纳米粒子靶向效果示意图见图1。实施例1宫颈癌肿瘤细胞中DMSO对于TAT-QD增加靶的方法与效果。具体操作步骤为：待HeLa细胞贴壁后，分别选用正常的细胞培养液(含10％胎牛血清的DMEM培养基)以及含体积浓度为1％DMSO的细胞培养液。将TAT-QD以相同的浓度分别分散在上述两种培养液中。经过与细胞在培养箱(37℃，5％CO2)中共培养到指定的时间后后，在激光共聚焦显微镜下观察。为了共定位细胞器与量子点的相对位置，我们采用细胞核染料Hoechst33342对细胞核进行染色，采用DiO对细胞膜和内含体进行染色。细胞核染色方法：除去细胞培养液，用PBS洗涤一次。在玻底培养皿中加入600μL浓度为2μM的Hoechst33342染液(溶解在DMEM中)，置于培养箱中培养15min。除去染液，用PBS洗涤3次后用荧光显微镜观察。细胞膜染色方法：除去细胞培养液，用PBS洗涤一次。在玻底培养皿中加入600μL浓度为5μM的Di本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)制备具有靶向效果的纳米粒子将纳米粒子量子点表面连上穿膜肽，得到具有靶向效果的纳米粒子；2)细胞摄取具有靶向效果的纳米粒子向培养液中滴加入助溶剂，将修饰过的量子点分散到助溶剂的培养液中，滴加到细胞培养皿中，放入细胞培养箱中进行共培养；3)通过荧光共定位观测量子点在细胞内的分布情况经过与细胞在培养箱中共培养后，在激光共聚焦显微镜下观察；采用细胞核染料对细胞核进行染色，采用对细胞膜和内含体进行染色，共定位细胞器与量子点的相对位置；通过荧光共定位测定来测试量子点纳米粒子在活细胞内从囊泡逃脱的比例、靶向输送到细胞核的比例；4)通过MTT方法测定细胞毒性。

【技术特征摘要】
1.一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)制备具有靶向效果的纳米粒子将纳米粒子量子点表面连上穿膜肽，得到具有靶向效果的纳米粒子；2)细胞摄取具有靶向效果的纳米粒子向培养液中滴加入助溶剂，将修饰过的量子点分散到助溶剂的培养液中，滴加到细胞培养皿中，放入细胞培养箱中进行共培养；3)通过荧光共定位观测量子点在细胞内的分布情况经过与细胞在培养箱中共培养后，在激光共聚焦显微镜下观察；采用细胞核染料对细胞核进行染色，采用对细胞膜和内含体进行染色，共定位细胞器与量子点的相对位置；通过荧光共定位测定来测试量子点纳米粒子在活细胞内从囊泡逃脱的比例、靶向输送到细胞核的比例；4)通过MTT方法测定细胞毒性。2.根据权利要求1所述的一种提高纳米级别物质在活细胞内部靶向输送效果的方法，其特征在于：所述的具有靶向效果的...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮刚，雍雪青，杨轩，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32