人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法技术

本发明专利技术属生物医学研究与应用领域，涉及人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法，本发明专利技术从人类多能干细胞定向分化形成心肌细胞后对人类心室肌细胞进行特异性筛选纯化及大量制备。本发明专利技术利用基因组编辑技术，构建MYL2基因结尾携带新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因的人类多能干细胞细胞系，并定向诱导分化为心肌细胞，进而通过新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因纯化得到人类心室肌细胞，其可与任意支架材料结合培养形成性质不同的各种工程化人类心室肌组织。本发明专利技术的人类心室肌细胞具备与正常人类心室肌细胞相似的表型及电生理反应，来源广泛，且能长期体外培养。为针对心室肌损伤与疾病的治疗手段和筛选有效的药物提供了良好的平台。

Screening and preparation methods of human ventricular myocytes derived from human pluripotent stem cells

The invention belongs to the field of biomedical research and application, which involves the screening and preparation methods of human ventricular myocytes from human pluripotent stem cells. The present invention has specific screening, purification and large amount preparation of human ventricular myocytes from the directional differentiation of human pluripotent stem cells to the formation of cardiac myocytes. The present invention uses genomic editing technique to construct human pluripotent stem cell lines with MYL2 gene ending with neomycin or green fluorescent protein screening gene and differentiate into cardiomyocytes by directional induction, and then purify human ventricular myocytes by screening gene of neomycin or green fluorescent protein, which can be used with any scaffold. All kinds of engineered human ventricular muscle tissue were formed by different materials. The human ventricular myocytes of the invention have similar phenotypic and electrophysiological responses to normal human ventricular myocytes, which are widely distributed and can be cultured in vitro for a long time. It provides a good platform for the treatment of ventricular injury and disease and screening effective drugs.

【技术实现步骤摘要】
人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法
本专利技术属生物医学研究与应用领域，具体涉及通过人类多能干细胞定向分化心肌细胞后进行心室肌细胞的筛选及制备方法。
技术介绍
现有技术公开了心血管疾病是危害人类健康的“头号杀手”，据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年死于心血管疾病的人数高达1710万，占全球死亡人数的29％，并以每年10.42％的速度递增发病率和致死率呈逐年增长态势，防治现状堪忧。虽然传统的药物治疗、介入治疗和搭桥手术等方法的应用改善了缺血性心脏病患者的预后，但仍无法挽救已经死亡的心肌细胞、逆转心室重构及后续的心力衰竭。心肌缺血、梗死后心肌修复和功能重建已成为该领域全球性的难题，亟需探索新的治疗方法和途径。由人类心脏解剖与冠状动脉的生理特点所决定，目前绝大多数的心肌梗死患者其心肌坏死的部位都位于心室肌，因此，未来心脏的再生治疗对于患者自体的心室肌细胞有很大的需求。研究显示，绝大多数的心肌细胞都处于终末分化状态，自我再生的能力十分有限；而多能性干细胞(包括人类胚胎干细胞(hESCs)和诱导多能性干细胞(hiPSCs))具有多向分化潜能及自我更新能力，可以无限增值，理论上可以分化为成年人类任何一种的体细胞。因此将多能性干细胞定向分化心血管系统细胞，通过心肌再生和血管新生等机制替代梗死的心肌组织，逐渐成为极有前景的心脏疾病治疗新方法。目前，虽然已有若干关于多能干细胞往心肌细胞方向分化方法的报道，但分化的心肌细胞纯度往往不够，一般含有一定比例的心室肌细胞、心房肌细胞、成纤维细胞，平滑肌细胞，内皮细胞，窦房结起搏细胞，这些混合性的细胞植入心梗动物中引起心律失常，导致模型动物死亡。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法，通过定向分化和药物筛选或者流式分选获得没有自主搏动的高纯度人类心室肌细胞，将可用于未来的自体心室肌细胞移植。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术存在的缺陷针对目前心室肌细胞来源的限制，提供人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法。利用基因工程手段，建立一组MYL2基因结合新霉素(Neomycin)和MYL2基因结合绿色荧光蛋白(eGFP)的多能干细胞细胞株，通过定向分化和药物筛选或者流式分选获得没有自主搏动的高纯度人类心室肌细胞，可用于未来的自体心室肌细胞移植。或者结合组织工程学，生产制备有功能的可用于移植的工程化人造人类心室肌组织。本专利技术利用基因编辑技术如TALEN或CRISPR/CAS9技术介导基因重组，将带有用于心室肌细胞筛选标记的新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因，导入人类多能干细胞(包括人类胚胎干细胞和诱导多能性干细胞)基因组中特定的MYL2基因位点之后，建立用于人类心室肌筛选的多能干细胞株，进而通过多能干细胞定向分化心肌细胞技术(该技术为已公开的成熟技术，具体实施步骤见Lianetal.，NatureProtocols，2012；8：162-75)，通过新霉素药物筛选或绿色荧光蛋白流式分选制备可用于研究与应用的人类心室肌细胞。具体的，本专利技术提供了人类多能干细胞定向分化心肌细胞后的人类心室肌细胞的筛选纯化方法，其特征在于，利用基因组编辑技术，如TALEN、CRISPR/CAS9或任何有效的基因重组技术，编辑人类多能干细胞基因组，构建特定的MYL2基因结尾携带新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因的人类多能干细胞细胞株，其包括步骤：A、构建针对靶基因MYL2(该靶基因编辑的蛋白为心室肌细胞的特异标志物)的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑质粒；B、构建带有步骤A所述靶基因的同源基因结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记的供体质粒(如图1所示)；C、培养良好的未分化的人类多能干细胞，包括人类胚胎干细胞与通过体外重编程正常人类个体的体细胞所获得的人类诱导多能性干细胞(人iPS细胞)；D、将步骤A获得的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑质粒与步骤B获得的MYL2同源基因供体质粒共电转入人类多能干细胞，通过基因重组将MYL2同源基因结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记导入人类多能干细胞的基因组；E、通过基因测序与单克隆筛选获得成功同源重组的带有MYL2结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记的人类多能干细胞，并建立相应细胞株；F、将步骤E所述获得的带有MYL2结合药物或荧光筛选标记的人类多能干细胞细胞株，通过现有公开的人类多能干细胞定向分化心肌细胞技术，得到未经过筛选纯化的人类心肌细胞，包括人类心室肌细胞、心房肌细胞、窦房结起搏细胞、以及属于人类心脏内其他类别的细胞；G、将步骤F中未经筛选纯化的分化后的人类心肌细胞，通过新霉素药物筛选或绿色荧光蛋白流式细胞仪分选进行纯化，使人类心室肌细胞的比例达到95％以上(如图2所示)；H、将步骤G中所述的经过新霉素或绿色荧光蛋白筛选的人类心室肌细胞进行验证，结果显示其具有正常人类心室肌细胞的相应表型(如图3所示)。本专利技术提供了用于人类心室肌细胞筛选的人类多能干细胞细胞株的制备方法，即利用基因组编辑技术，如TALEN、CRISPR/CAS9或任何有效的基因重组技术，通过基因重组方法编辑人类多能干细胞基因组，构建人类心室肌-多能干细胞细胞株。更具体的，本专利技术的用于人类心室肌细胞筛选的人类多能干细胞细胞株的制备方法，包括步骤：1)TALEN或CRISPR/CAS9质粒及MYL2同源基因供体质粒的构建在TALEN或CRISPR/CAS9骨架质粒的基础上，利用PCR、限制性内切酶、连接酶、点突变等分子生物学方法构建针对MYL2的TALEN或CRISPR/CAS9质粒(该质粒带有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，可用于筛选接受了该质粒的阳性细胞克隆)，同时构建带MYL2同源基因供体质粒；2)针对MYL2基因的TALEN或CRISPR/CAS9质粒的活性检测用TALEN或CRISPR/CAS9质粒转染293T细胞，提取嘌呤霉素筛选后存活细胞的基因组DNA进行PCR，通过观察DNA测序结果的套峰强弱、T7E1错配酶酶切效率及TA克隆测序比例检测活性；3)将活性高的TALEN或CRISPR/CAS9质粒与MYL2同源基因供体质粒共电击转染进入人类多能干细胞计数合适的细胞量，加入相应比例的TALEN或CRISPR/CAS9与MYL2同源基因供体质粒，选用合适的电压、脉冲强度及脉冲次数进行电转；针对不同多能干细胞细胞系，所选用的电压、脉冲强度及脉冲次数需要经过实验确定最佳数值，电压范围一般在1100毫伏-1400毫伏，脉冲范围一般为0.5-2毫安，脉冲次数一般为1-3次；4)筛选成功同源重组的用于人类心室肌筛选的多能干细胞系挑选嘌呤霉素筛选后存活的克隆，提取基因组DNA，利用PCR、TA克隆测序及SouthernBlot等分子生物学方法鉴定杂合或纯合的人类心室肌-多能干细胞系；5)体外培养人类正常及用于人类心室肌筛选的多能干细胞、分化心肌细胞采用专业的诱导多能性干细胞培养液(可于生物试剂市场上购买，如加拿大StemcellTechnology公司)，在37℃含5％二氧化碳培养箱培养内培养人类多能性干细胞，细胞长满后，运用已知方法，联合运用Wnt通路的促进剂(小分子药物CHIR99021)和抑制剂(小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法，其特征在于，利用基因组编辑技术，编辑人类多能干细胞基因组，构建特定的MYL2基因结尾携带新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因的人类多能干细胞细胞株，其包括步骤：A、构建针对靶基因MYL2的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑质粒；B、构建带有步骤A所述靶基因的同源基因结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记的供体质粒；C、培养良好的未分化的不同来源的人类多能干细胞，其中包括制备的人类胚胎干细胞与通过体外重编程正常人类个体的体细胞获得的人类诱导多能性干细胞人iPS细胞；D、将步骤A获得的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑质粒与步骤B获得的MYL2同源基因供体质粒共电转入人类多能干细胞，通过基因重组将MYL2同源基因结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记导入人类多能干细胞的基因组；E、通过基因测序与单克隆筛选获得成功同源重组的带有MYL2结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记的人类多能干细胞，并建立相应细胞株；F、将步骤E所述获得的带有MYL2结合药物或荧光筛选标记的人类多能干细胞细胞株，通过人类多能干细胞定向分化心肌细胞技术，得到未经过筛选纯化的人类心肌细胞；G、将步骤F中未经筛选纯化的分化后的人类心肌细胞，通过新霉素药物筛选或绿色荧光蛋白流式细胞仪分选进行纯化；H、将步骤G中所述的经过新霉素或绿色荧光蛋白筛选的人类心室肌细胞进行验证，得具有正常人类心室肌细胞的相应表型。...

【技术特征摘要】
1.人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法，其特征在于，利用基因组编辑技术，编辑人类多能干细胞基因组，构建特定的MYL2基因结尾携带新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因的人类多能干细胞细胞株，其包括步骤：A、构建针对靶基因MYL2的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑质粒；B、构建带有步骤A所述靶基因的同源基因结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记的供体质粒；C、培养良好的未分化的不同来源的人类多能干细胞，其中包括制备的人类胚胎干细胞与通过体外重编程正常人类个体的体细胞获得的人类诱导多能性干细胞人iPS细胞；D、将步骤A获得的TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑质粒与步骤B获得的MYL2同源基因供体质粒共电转入人类多能干细胞，通过基因重组将MYL2同源基因结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记导入人类多能干细胞的基因组；E、通过基因测序与单克隆筛选获得成功同源重组的带有MYL2结合新霉素或绿色荧光蛋白筛选标记的人类多能干细胞，并建立相应细胞株；F、将步骤E所述获得的带有MYL2结合药物或荧光筛选标记的人类多能干细胞细胞株，通过人类多能干细胞定向分化心肌细胞技术，得到未经过筛选纯化的人类心肌细胞；G、将步骤F中未经筛选纯化的分化后的人类心肌细胞，通过新霉素药物筛选或绿色荧光蛋白流式细胞仪分选进行纯化；H、将步骤G中所述的经过新霉素或绿色荧光蛋白筛选的人类心室肌细胞进行验证，得具有正常人类心室...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宁，李宾，杨慧，梁倩倩，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31