一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备制造技术

一种用于医学领域的基因芯片检测单克隆质控标准株的制备，其特征在于，通过CD138单抗的靶向捕获，使CD138单抗的IgGFc端与具有IgGFc受体的基因组异常的有核细胞结合，而CD138单抗的IgGFab端与瘤细胞结合，形成骨髓瘤细胞‑CD138单抗‑有核细胞的结合物，并在聚乙二醇的共同作用下促使胞膜接触和特异融合，使全异常基因组被植入瘤细胞并随着瘤细胞的扩增而扩增，进而筛选并制备基因组异常的单克隆质控标准株，以基因芯片、高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR或测序验证目标异常基因，用以替代国外基因数据库进行已知变异基因组的比对和基因芯片检测新方法的建立，并用于基因芯片检测的室内质控和室间质评。

【技术实现步骤摘要】
一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备
本专利技术涉及医学领域的一种产前基因芯片检测单克隆质控标准株的制备，主要应用于胎儿染色体拷贝数异常或单核苷酸多态性异常检测的室内质控或室间质评。
技术介绍
基因芯片是最近发展起来的一项高通量的基因表达分析技术，是在尼龙膜表面打印点阵或硅玻片表面合成能代表不同基因的成千上万个寡核苷酸作为探针.与放射性同位素或荧光素标记的待测材料中的DNA或cDNA互补结合，采用放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描杂交信号，最后由计算机集中进行分析处理。获得的杂交信号强度及分布模式，可以反映被检样本中有关基因的表达情况。基因芯片的应用取决于探针的设计，根据探针及探针组合的不同，基因芯片可分为CNV+SNP芯片、CNV芯片和SNP芯片。SNP芯片可以检测单核苷酸多态性及染色体数目异常和SNPs(杂合性缺失/单亲二倍体)，SNP+CNVs芯片可以检测拷贝数变异(缺失、重复、非平衡易位、等臂染色体)，CNV可以检测拷贝数变异。目前基因芯片已成为产前诊断的主流技术，尤其应用于生长发育迟缓、先天性疾病、自闭症患儿、超声异常病例和流产物的检测。产前诊断的质量控制是确保诊断结果准确性的前提，[卫医发]1997第31号文件、《临床实验室管理办法》、《医院评审标准实施细则》等均指出，实验室必须有规范的质量控制标准。产前诊断的质量控制也是许多学者致力于研究的重要课题。Sikkema-RaddatzB等研究了产前细胞遗传学诊断的细胞培养及制片过程的影响因素，提出了室内质量控制的方法。FriesN和MerzE等提出了影像学产前诊断的质量控制方法。Pihlk等认为必须加强产前筛查的质量控制。BastienP等在2002～2004年期间对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间质量评价，认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重要的作用。国内也有较多的产前诊断质控物研究的文献报道，包括以EB病毒转染疑难染色体异常细胞而构建染色体核型分析的质控细胞株、以EB病毒转染或以脂质体介导SV40和/或hTERT基因转染染色体数目异常细胞而构建染色体非整倍体荧光原位杂交检测的质控细胞株，但这些方法由于质控细胞株构建的成功率低下等原因，难以满足产前基因芯片检测的质控物需求，目前尚无理想的产前基因芯片检测的质控物，因开展基因芯片检测的室内质控和室间质评需要大量的同种类基因异常细胞，而这种基因异常的原代细胞很难传代扩增且很难获取，造成了该质控细胞的缺乏而限制了该项质控的开展。所以将基因异常的原代细胞转化为能无限扩增的细胞株，是解决质控细胞缺乏的理想方法。细胞融合是20世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定条件诱导下使两个或多个细胞(原生质体)相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，形成杂种细胞。细胞融合所形成的新细胞(杂合细胞)得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性。细胞融合已成为细胞工程的核心技术之一，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛的应用价值，它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。1974年发现了聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，当加入一定分子量的PEG时，融合效率较病毒诱导法可提高1000倍以上，经过研究发现PEG在融合过程中起着稳定和诱导凝集作用。后来人们又发现还有许多其他的化学剂可使细胞凝集并融合，如磷酸盐、高级脂肪酸衍生物、脂质体等，但以聚乙二醇的效果较好。所以1975年以后，利用PEG诱导细胞融合逐渐发展成为一种重要的化学融合方法，PEG法一直沿用至今，即使到了近年来已不断发展为电穿孔或电融合的电场诱导法、激光诱导法、微流控芯片法、高通量芯片法的今天，因新方法的设备和实验费用昂贵等原因，PEG法依然以其低廉的实验成本和相对较高的融合率而在许多实验中依然被大量应用，最常用的是淋巴细胞杂交瘤技术，又称为单克隆抗体技术，是将特异抗原免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞株在含有PEG(1000-2000)的选择培养基中进行融合，得到既能产生单克隆抗体又能在体外无限扩增的杂交瘤细胞株。以此制备的单克隆抗体已经商品化，已广泛应用于研究许多疾病的诊断、治疗和预防。但至今仍未见将细胞融合技术应用于制备产前基因芯片检测的质控细胞以开展该项检测的室内质控和室间质评的文献报道。
技术实现思路
为了制备一种基因芯片检测单克隆质控标准株以便开展该项检测的室内质控和室间质评，本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是要提供一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备方法。本专利技术的目的是这样实现的：通过CD138单抗的靶向捕获，使CD138单抗的IgGFc端与具有IgGFc受体的基因组异常的有核细胞结合，而CD138单抗的IgGFab端与瘤细胞结合，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗-有核细胞的结合物，并在聚乙二醇的共同作用下促使胞膜接触和特异融合，使全异常基因组被植入瘤细胞并随着瘤细胞的扩增而扩增，进而筛选并制备基因组异常的单克隆质控标准株，以基因芯片、高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR或测序验证目标异常基因，用以替代国外基因数据库进行已知变异基因组的比对和基因芯片检测新方法的建立，并用于基因芯片检测的室内质控和室间质评。本专利技术首次发现基因异常细胞与鼠瘤细胞融合能形成同具两者性质的融合细胞并能借助鼠瘤细胞的无限扩增而扩增全异常基因组的方法，将其应用于制备基因芯片检测的质控标准株，解决了长期以来该项检测无室内和室间质评物的问题，并将以可比性较差的基因数据库为参照的传统基因筛查方法优化为以可比性较好的质控标准标为参照的基因诊断新方法，以提高其检测质量和可靠性。而且本专利技术根据B细胞等有核细胞具有IgGFc的结合受体和瘤细胞具有CD138单抗的IgGFab结合受体的特性，在细胞融合中通过CD138单抗对B细胞和瘤细胞的靶向捕获，使CD138单抗的IgGFc端与有IgGFc结合受体的B细胞结合，而CD138单抗的IgGFab端与瘤细胞结合，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗-B细胞的结合物，从而易于胞膜接触和特异融合，增加了有效融合率，减少了B细胞与B细胞、瘤细胞与瘤细胞的无效融合。具体实施方式图1是本专利技术的CD138单抗助融示意图。图2是本专利技术的细胞融合实拍图。如图1，1表示具有CD138单抗Fab受体的骨髓瘤细胞，2表示CD138单抗(IgG)，3表示具有CD138单抗Fc受体的基因突变细胞，CD138单抗(IgG)的另一个Fab端还可结合一个骨髓瘤细胞，通过CD138单抗将待融合的细胞连接在一起，有利于在PEG的作用下融合。如图2，在CD138单抗的助融下，经HAT筛选2周，在倒置显微镜下拍摄(40X)，得到杂交瘤细胞克隆。下面结合图1和图2，对本专利技术的实施方案作具体的描述。1、待融合细胞(含致病性的目标变异基因)：包括单基因病、多基因病、染色体病、线粒体病或体细胞病的基因缺失、重复、突变及拷贝数变异的淋巴细胞、单核细胞、羊水细胞和绒毛组织细胞。本专利技术采集人β-地中海贫血患者的淋巴细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备，其特征在于，以CD138单抗和聚乙二醇共同介导全致病基因组移植鼠SP2/0瘤细胞并随着鼠瘤细胞的扩增而扩增，进而筛选并制备基因组异常的单克隆质控标准株，用于基因芯片检测的室内质控和室间质评。

【技术特征摘要】
1.一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备，其特征在于，以CD138单抗和聚乙二醇共同介导全致病基因组移植鼠SP2/0瘤细胞并随着鼠瘤细胞的扩增而扩增，进而筛选并制备基因组异常的单克隆质控标准株，用于基因芯片检测的室内质控和室间质评。2.根据权利要求1所述的一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备，其特征在于，所述CD138单抗介导指CD138单抗的IgGFc端与具有IgGFc受体的有核细胞结合，而CD138单抗的IgGFab端与鼠SP2/0瘤细胞结合。3.根据权利要求1和2所述的一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备，其特征在于，CD138单抗与鼠SP2/0瘤细胞以1∶1调配。4.根据权利要求1所述的一种基因芯片检测单克隆质控标准株的制备，其特征在于，以25％PEG介导没有IgGFc受体的有核细胞。5.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，黄荷凤，温馨，杨艳梅，朱小明，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江,33