一种简便寻找细胞特异性抗原的方法技术

本申请公开了一种简便寻找细胞特异性抗原的方法。包括以下步骤：A.获得抗正常细胞或正常组织的血清；B.用步骤A获得的抗血清或纯化出来的多克隆抗体处理动物；C.用对应的癌细胞或癌变组织免疫步骤B处理过的动物；D.分离步骤C处理后动物的B细胞；E.分离后的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得单克隆抗体细胞株；用单克隆抗体细胞株制备单克隆抗体；F.步骤E获得的单克隆抗体亲和纯化癌细胞的细胞裂解液，得到与其结合的抗原蛋白。利用本发明专利技术新方法，不用或者基本不用后续的负筛选过程。这无疑大大地提高了筛选的效率。

A simple method for finding cell specific antigen

This application discloses a simple method for finding cell specific antigen. Including the following steps: A. obtained the serum against normal or normal tissues; the antiserum obtained by B. or the purified polyclonal antibody used in step A to treat animals; C. used the corresponding cancer cells or the cancerous tissue immunized step B treated animals; D. separation step C treated B cells of the animal after treatment; B cells after E. separation and myeloma. Cell fusion, monoclonal antibody cell lines were obtained; monoclonal antibodies were prepared with monoclonal antibody cell lines; monoclonal antibodies obtained by F. step E affinity purified the cell lysates of cancer cells and obtained the antigen protein that was combined with them. By using the new method of the invention, there is no need or no need for subsequent negative screening process. This undoubtedly greatly improves the efficiency of screening.

【技术实现步骤摘要】
一种简便寻找细胞特异性抗原的方法
本专利技术涉及分子生物学抗原抗体筛选
，特别涉及一种简便寻找细胞特异性抗原的方法。
技术介绍
在目前的肿瘤的生物治疗方案中，免疫治疗是一直是研究和应用的热点。总体上来说，目前主要有两种主要的方式。一种是基于细胞免疫的，即让杀伤性T细胞识别并杀伤癌细胞；另外一种是基于体液免疫的，即获得肿瘤的特异性抗体，然后通过抗体激活补体途径或通过偶联在抗体上的药物特异性杀伤癌细胞。但是不管哪种免疫疗法，让免疫系统识别癌细胞是最关键的一步。但是癌细胞是一种逃逸了机体免疫监视的恶性增生细胞，它尽可能“伪装”成正常细胞，以避免被机体免疫系统识别并清除，因此想要免疫系统识别癌细胞变的非常困难。对于肿瘤抗体治疗来说，最关键的步骤是获得癌细胞特异性的单克隆抗体。目前主要有两种方式获得肿瘤特异性抗体：第一种，直接用某种癌细胞或其提取物免疫小鼠，并获得抗该癌细胞的单抗，然通过用对照细胞(如对应的正常细胞)再对这些抗体进行负筛选，最终获得特异性抗体；第二种，首先通过分子生物学手段获得癌细胞特异性的蛋白，尤其是膜蛋白，然后用这个蛋白去免疫并获得单克隆抗体。然而这两种方法都有很多问题。如前所述癌细胞是逃逸了免疫系统监控的细胞，所以虽然从分子尺度上来看，癌细胞的确与正常细胞有很多不同，但是这种不同并不足以激活机体的免疫系统。所以，如果用第一种方法获得抗体，本专利技术往往需要从几千甚至几万个克隆中才能够筛选到一个癌细胞特异性的抗体。也因为这种缺陷，这种方法已经基本被淘汰。第二种方法也是目前主流的方法，人们已经通过这种方法获得了一些抗体并获得应用。但是，本专利技术知道，并非一种肿瘤的癌细胞一定会表达这种抗原，即使在一个肿瘤组织内也不是所有的癌细胞都会表达某种特定的抗原。所以，这种抗体仅仅可以识别并杀伤表达这种抗原的癌细胞，而不表达这种抗原的癌细胞却因此被筛选出来并恶性增生。癌细胞的这种高变异性也是癌症难以治疗的原因之一。正因为癌细胞的多变性和多样性，越来越多的业内专家认为，对于免疫疗法来说，只有几种或更多的抗体联合治疗，即“鸡尾酒疗法”才有可能解决这个问题。但是如前所述，通过目前主流的这两种方法想获得多种特异性的抗体是非常困难的。因此，如何尽可能高效地获得肿瘤特异性的抗体，已经成为肿瘤抗体治疗的瓶颈问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供了一种简便寻找细胞特异性抗原的方法。本专利技术方法获得了11种抗HepG2的单克隆抗体。这些单抗对HepG2有特异性的识别，而不识别或基本不识别HHcell。同时，与其他组织来源的癌细胞相对比，这些单抗都对HepG2有特异性的识别。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种简便寻找细胞特异性抗原的方法，包括以下步骤：A.获得抗正常细胞或正常组织的血清；B.用步骤A获得的抗血清或纯化出来的多克隆抗体处理动物；C.用对应的癌细胞或癌变组织免疫步骤B处理过的动物；D.分离步骤C处理后动物的B细胞；E.分离后的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得单克隆抗体细胞株；用单克隆抗体细胞株制备单克隆抗体；F.步骤E获得的单克隆抗体亲和纯化癌细胞的细胞裂解液，得到与其结合的抗原蛋白。所述癌细胞优选为肝癌细胞。所述获得未知特异性抗原癌细胞特异性抗体的方法，优选进一步包括：G.质谱分析步骤F获得的抗原蛋白。所述步骤A可以进一步包括：A1.收集细胞；A2.重选细胞；A3.免疫后获得血清。所述子步骤A1可以进一步包括：正常细胞培养扩增至密度达到75～85％时，吸去培养液；先用PBS洗去残留的培养基，然后再用PBS/8-12mMEDTA处理细胞，使细胞脱落并最终吹打收集细胞。所述子步骤A2可以进一步包括：800～1200转，3-5分钟离心后，用1％多聚甲醛吹散细胞沉淀，并室温固定0.3～0.7小时，然后通过离心洗去多聚甲醛，并用PBS重选细胞，细胞计数后，最终保存于-20℃。所述子步骤A3可以进一步包括：取100万细胞定容于200μlPBS并与200μl完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂涡旋振荡混合；免疫5-7周龄小鼠，每只小鼠用100万细胞免疫，免疫间隔2周，共2-4次；最后一次免疫5-15天后采血收集血清。所述步骤C优选进一步包括：C1.收集细胞；C2.重选细胞；C3.免疫后获得B细胞。所述子步骤B1优选进一步包括：癌细胞培养扩增至密度达到78-82％左右时，吸去培养液；先用PBS洗去残留的培养基，然后再用PBS/7-13mMEDTA处理细胞，使细胞脱落并最终吹打收集细胞。所述子步骤B2优选进一步包括：900～1100转，3-5分钟离心后，用0.5-1.5％多聚甲醛吹散细胞沉淀，并室温固定0.3～0.7小时，然后通过离心洗去多聚甲醛，并用PBS重选细胞，细胞计数后，最终保存于-20℃。本专利技术有益效果包括：1)本专利技术筛选出的11种抗体是用HepG2细胞直接筛选出来的，也就是说没经过HHcell或其他细胞的负筛选。利用本专利技术新方法，不用或者基本不用后续的负筛选过程。这无疑大大地提高了筛选的效率。2)本专利技术方法无需用已知抗原进行免疫，特别适合获得未知特异性抗原癌细胞的特异性抗体。3)本专利技术方法提供了一种简单的寻找细胞特异性抗原的方法，可以用这11种单克隆抗体去亲和纯化HepG2的细胞裂解液，这样本专利技术就得到了可以与它们结合的蛋白。然后用质谱去分析这些蛋白，就可以知道这些蛋白是什么，方便了进一步的深入研究。附图说明图1为本专利技术实施例所述体内去除癌细胞与相应正常细胞共同抗原并获得抗癌细胞单抗的原理图；图2为本专利技术实施例所述抗HHcell的血清对HHcell和HepG2的识别能力对比图；图3为本专利技术实施例所述11种单克隆抗体特异性识别能力柱形图；图4为本专利技术实施例所述其它类型的细胞与本专利技术单抗对HepG2特异性识别对比图；图5为本专利技术实施例所述体外去除癌细胞与相应正常细胞共同抗原并最终获得抗癌细胞单抗的原理图；图6为本专利技术实施例所述体外法获得的单克隆抗体特异性识别HepG2能力柱形图。具体实施方式下面结合实施例详述本专利技术。为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术并不局限于这些实施例。如无特别说明，本专利技术的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。在众多肿瘤的免疫疗法过程中，获得特异性抗癌细胞的单克隆抗体一直是其中的一个关键因素。但是遗憾的是到目前为止，还没有一种可以高效筛选该抗体的方法。本专利技术提供了一种高效获得抗癌细胞单克隆抗体的方法。本专利技术方法的核心设计思想是，用抗相对应的正常细胞抗体在体内直接去掉癌细胞与正常细胞共有的抗原，而不是在体外进行大规模的筛选，本专利技术将这种方法称为“抗体滤镜”。通过这种方法，本专利技术以肝癌细胞HepG2为模型实施例，获得了11个抗HepG2的单克隆细胞株。在本专利技术的实验中，本专利技术发现这些抗体对HepG2有特异性识别，而对正常的肝细胞(HHcell)和其他组织来源的细胞基本不识别。通过本专利技术的试验，证明了这是一种可以高效筛选抗癌细胞单克隆抗体的方法，而未来这种方法与人源化技术或药物偶联技术相结合将有可能应用于癌症的治疗。如图1所示，为本专利技术实施例所述体内去除癌细胞与相应正常细胞共同抗原并获得抗癌细胞单抗的原理图。其中步骤为：1，用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简便寻找细胞特异性抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.获得抗正常细胞或正常组织的血清；B.用步骤A获得的抗血清或纯化出来的多克隆抗体处理动物；C.用对应的癌细胞或癌变组织免疫步骤B处理过的动物；D.分离步骤C处理后动物的B细胞；E.分离后的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得单克隆抗体细胞株；用单克隆抗体细胞株制备单克隆抗体；F.步骤E获得的单克隆抗体亲和纯化癌细胞的细胞裂解液，得到与其结合的抗原蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种简便寻找细胞特异性抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.获得抗正常细胞或正常组织的血清；B.用步骤A获得的抗血清或纯化出来的多克隆抗体处理动物；C.用对应的癌细胞或癌变组织免疫步骤B处理过的动物；D.分离步骤C处理后动物的B细胞；E.分离后的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得单克隆抗体细胞株；用单克隆抗体细胞株制备单克隆抗体；F.步骤E获得的单克隆抗体亲和纯化癌细胞的细胞裂解液，得到与其结合的抗原蛋白。2.根据权利要求1所述获得未知特异性抗原癌细胞特异性抗体的方法，其特征在于，所述癌细胞为肝癌细胞。3.根据权利要求1所述获得未知特异性抗原癌细胞特异性抗体的方法，其特征在于，进一步包括：G.质谱分析步骤F获得的抗原蛋白。4.根据权利要求1所述获得未知特异性抗原癌细胞特异性抗体的方法，其特征在于，所述步骤A进一步包括：A1.收集细胞；A2.重选细胞；A3.免疫后获得血清。5.根据权利要求4所述获得未知特异性抗原癌细胞特异性抗体的方法，其特征在于，所述子步骤A1进一步包括：正常细胞培养扩增至密度达到75～85％时，吸去培养液；先用PBS洗去残留的培养基，然后再用PBS/8-12mMEDTA处理细胞，使细胞脱落并最终吹打收集细胞。6.根据权利要求4所述获得未知特异性抗原癌细胞特异性抗体的方法，其特征在于，所述子步骤A2进一步包括：800～1200转，...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴新辉，
申请(专利权)人：裴新辉，
类型：发明
国别省市：山东,37