一种环肽及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种环肽及其制备方法和用途。所述环肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述环肽是通过其氨基酸序列首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的，该环肽命名为RD808。本发明专利技术利用多种数据库，分析β1‑AR‑ECII的更短优势抗原决定簇，利用固相肽合成法，成功合成了小分子量的环肽RD808，并且在细胞和在体水平验证了此肽对心肌的保护效果；本发明专利技术的环肽RD808治疗心衰具有经济负担小、无创、方便的优点；与其他大分子肽类相比，此环肽的机体免疫反应较小，能够实现安全用药。

【技术实现步骤摘要】
一种环肽及其制备方法和用途
本专利技术属于免疫学
，涉及一种环肽及其制备方法和用途。
技术介绍
针对β1-肾上腺素受体细胞外第二环(β1-AR-ECII)的自身抗体(Autoantibodiesagainstβ1-adrenergicreceptor,β1-AA)参与心力衰竭的发生发展，因此临床上对β1-AA阳性心衰患者的针对性治疗方式主要有两种方法：体外免疫吸附法和中和抗体法。体外免疫吸附，即IA(Immunoadsorption)。这种方法是将患者血液单采后，利用特异性或非特异性的IgG凝胶柱去除人体免疫球蛋白IgG，以达到去除自身抗体的目的。然而，IA虽然能有效的去除患者血清中的自身抗体，但这种方法仍然存在很大的问题：患者必须在特定的单采中心停留数天之久；血液单采治疗费用昂贵；操作程序复杂；此方法需要置换血液，为有创治疗。由于以上几点不足，IA的临床应用受到很大的限制。相较于IA，抗体中和法通用性强，能够有效中和循环血中的自身抗体，达到逆转心脏功能的目的；同时侵入性低、创伤小，治疗费用相对较少，不必反复住院进行手术。这些优点预示着今后肽类药物将可能会成为此类疾病治疗的热门手段之一。肽类中和法是近年研究的重点，为自身抗体相关疾病的治疗提供了良好的基础。根据β1-AR-ECII的氨基酸残基结构，合成针对性结合β1-AA的肽，中和β1-AA的损伤效应是治疗β1-AA阳性心血管疾病的新方法和新出路。已有文献和临床数据证实此类肽对心血管疾病的治疗效果，其中包括环肽和线肽，如COR-1(根据β1-AR-ECII的结构合成的环肽)、JNJ-54452840以及RI肽等，其中RI肽(d-DCCKPDNYCR)是目前报道的最小分子量肽，它包含10个氨基酸残基，将β1-AR-ECII被动免疫的新西兰白兔给予RI肽治疗，可以有效缓解β1-AA诱导产生的心房有效不应期缩短，治疗心律失常。尽管以上提到的几种肽已初见成效，但根据机体免疫应答系统的特点，抗原的分子量越小，其免疫原性越小，进入机体后其安全性就越高。值得指出的是，环肽的生物活性高、半衰期长、受体选择性高、分子内不存在游离的氨基端和羧基端，使得对氨基肽酶和羧基肽酶的敏感性大大降低，其结构具有一定的构象约束作用，环肽的这些特性使其较线型肽有更好的稳定性，其抗酶解能力比线型肽更强，这些特点使环肽具有更高的应用价值。
技术实现思路
基于上述现有技术的缺陷，为了寻求安全性更高、更稳定、更经济的环肽类药物，本专利技术的目的在于提供一种环肽及其制备方法和用途，通过分析β1-AR-ECII的更短优势抗原表位，合成了分子量更小、更经济的环肽。本专利技术的目的主要通过以下技术方案得以实现：一方面，本专利技术提供一种环肽，所述环肽的氨基酸序列为RRCYND(如SEQIDNO：1所示)，所述环肽是通过其氨基酸序列首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。本专利技术中将所述环肽命名为RD808。上述的环肽RD808，优选地，所述环肽RD808的结构式如式(I)所示：上述的环肽RD808中，优选地，所述环肽RD808的氨基酸序列是通过数据库分析β1-AR-ECII更短优势抗原决定簇而获得的。上述的环肽RD808中，优选地，所述β1-AR-ECII的全长氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。上述的环肽RD808中，优选地，所述数据库包括Chou&FasmanBeta-TurnPrediction、EminiSurfaceAccessibilityPrediction、Karplus&SchulzFlexibilityPrediction、Kolaskar&TongaonkarAntigenicity、ParkerHydrophilicityPrediction和BepipredLinearEpitopePrediction中的一种或多种的组合。另一方面，本专利技术还提供上述环肽RD808的制备方法，包括以下步骤：将所述环肽RD808的氨基酸的肽链残基R-R-C-Y-N-D的羧基端连接至CTC树脂上，获得全保护线性肽；然后对全保护线性肽进行环肽的合成，最后洗脱干燥后制成白色粉末，即为环肽RD808。上述的制备方法，优选地，合成全保护线性肽的具体步骤为：步骤一，称取2-CTC树脂和Fmoc-Asp(OtBu)-OH于固相合成反应器中，加入保护剂，在氮气保护下进行搅拌，然后加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)进行反应，并用甲醇(MeOH)进行封端，然后用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤并真空干燥，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTCresin；步骤二，向步骤一中得到的Fmoc-Asp(OtBu)-CTCresin中加入20％哌啶/DMF溶液进行脱保护，然后用二甲基甲酰胺洗涤并真空干燥，得到Asp(OtBu)-CTCresin；步骤三，称取Fmoc-Asn(Trt)-OH和缩合剂，加入二甲基甲酰胺溶解，冰浴下加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)进行预活化，将预活化后的混合液倒入步骤一中的固相合成反应器中，在氮气保护下进行搅拌与Asp(OtBu)-CTCresin反应，利用茚三酮监测反应，检测结果为阴性时停止反应，然后用二甲基甲酰胺洗涤并真空干燥得到Asn(Trt)-Asp(OtBu)-CTCresin；步骤四，重复步骤二和步骤三，依次连接氨基酸：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH得到H-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-CTCresin；然后用二甲基甲酰胺和甲醇分别进行洗涤并真空干燥得到目标线性肽树脂；步骤五，向目标线性肽树脂中加入TFA/DCM溶液进行裂解，抽滤收集滤液，调节滤液pH值为碱性，洗涤干燥并纯化后，得到全保护线性肽。上述的制备方法中，优选地，全保护线性肽合成环肽RD808的具体步骤为：将全保护线性肽溶解于保护剂中，加入缩合剂室温下进行反应，利用高效液相色谱和质谱联用检测反应是否完成，反应完成后，洗涤干燥并后，得到全保护环化肽；向全保护环化肽中加入TFA/TIS/H2O裂解液进行脱保护，反应后加入甲基叔丁基醚进行沉淀，离心洗涤并真空干燥纯化后，获得目标环肽，即为环肽RD808。上述的制备方法中，20％哌啶/DMF溶液、TFA/DCM溶液和TFA/TIS/H2O裂解液等溶液为本领域常规配方的溶液，可自制也可市售获得。上述的制备方法中，优选地，所述保护剂包括三氟乙酸(TFA)和/或二氯甲烷(DCM)；上述的制备方法中，优选地，所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、1-羟基苯并三唑(HoBt)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中的一种或多种。再一方面，本专利技术还提供上述环肽RD808在制备用于治疗心力衰竭的药物中的用途。另一方面，本专利技术还提供了一种药物，其中包含治疗有效量的本专利技术的上述环肽RD808。本专利技术利用多种数据库，分析β1-AR-ECII的更短优势抗原决定簇，利用固相肽合成法，成功合成了小分子量的环肽RD808，并且在细胞和在体水平验证了此肽对心肌的保护效果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环肽，其特征在于：所述环肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述环肽是通过其氨基酸序列首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。

【技术特征摘要】
1.一种环肽，其特征在于：所述环肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述环肽是通过其氨基酸序列首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。2.根据权利要求1所述的环肽，其特征在于：所述环肽的结构式如式(I)所示：3.根据权利要求1所述的环肽，其特征在于：所述环肽的氨基酸序列是通过数据库分析β1-AR-ECII更短优势抗原决定簇而获得的；所述β1-AR-ECII的全长氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。4.根据权利要求3所述的环肽，其特征在于：所述数据库包括Chou&FasmanBeta-TurnPrediction、EminiSurfaceAccessibilityPrediction、Karplus&SchulzFlexibilityPrediction、Kolaskar&TongaonkarAntigenicity、ParkerHydrophilicityPrediction和BepipredLinearEpitopePrediction中的一种或多种的组合。5.权利要求1-4任一项所述环肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述环肽的氨基酸的肽链残基R-R-C-Y-N-D的羧基端连接至CTC树脂上，获得全保护线性肽；然后对全保护线性肽进行环肽的合成，最后洗脱干燥后制成白色粉末，即为所述环肽。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，合成全保护线性肽的具体步骤为：步骤一，称取2-CTC树脂和Fmoc-Asp(OtBu)-OH于固相合成反应器中，加入保护剂，在氮气保护下进行搅拌，然后加入N,N-二异丙基乙胺进行反应，并用甲醇进行封端，最后用二甲基甲酰胺洗涤并真空干燥，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTCresin；步骤二，向步骤一中得到的Fmoc-Asp(OtBu)-CTCresin中加入20％哌啶/DMF溶液进行脱保护，然后用二甲基甲酰胺洗涤并真空干燥，得到Asp...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧荣，王雯，董玉，张苏丽，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11