一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法技术

本发明专利技术提供一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法，通过高温处理、硫酸铵层析蛋白和超滤，实现九香虫抗肿瘤蛋白组分的快速分离纯化，以解决现有方法步骤繁琐，对仪器要求高，常需要高效液相色谱仪、核酸蛋白层析仪等进行分离纯化，所涉及到的色谱柱、填料价格均较昂贵，纯化周期较长等问题。本发明专利技术属于生物技术领域。

A rapid method for isolation and purification of antineoplastic protein components from nine incense worms

The present invention provides a rapid method for separating and purifying the antitumor protein components of nine scent insects. Through high temperature treatment, ammonium sulphate chromatography protein and ultrafiltration, the rapid separation and purification of antitumor protein components of nine insect pests are realized in order to solve the tedious procedure of the existing methods, high requirement for the instrument, and often need high performance liquid chromatograph and nucleic acid protein. Chromatography and other separation and purification, the columns and fillers involved are expensive, and the purification cycle is long. The invention belongs to the field of biological technology.

【技术实现步骤摘要】
一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法
本专利技术提供一种九香虫抗肿瘤蛋白组分的快速分离纯化方法，属于生物
技术背景九香虫(AspongopuschinensisDallas)是昆虫纲半翅目兜蝽科昆虫，又称黑兜虫、瓜黑蝽、屁板虫、蜣螂虫、打屁虫和屁巴虫等，属东洋区系。因其理气止痛、温中助阳的功能以及含有抗癌、抗菌、抗凝血的药用成分而倍受人们的重视，然而其抗癌药用成分尚不明确。九香虫抗癌“知其然，不知其所以然”的境遇严重阻碍了它被国际学术界关注的进程，是九香虫资源深层次开发利用的桎梏，故急需对九香虫抗癌活性成分进行更深入的研究，为九香虫抗癌药物的研发及应用提供依据。笔者通过前期实验发现，九香虫血淋巴水溶性组分对胃癌SGC-7901增殖具有很强的抑制作用，进一步的研究结果显示，血淋巴水溶性组分能通过诱导胃癌SGC-7901凋亡而达到抗癌作用。但常规分离纯化抗癌活性组分的方法步骤繁琐，对于仪器要求很高，常需要高效液相色谱仪、核酸蛋白层析仪等进行分离纯化，所涉及到的色谱柱、填料价格均较昂贵，纯化周期较长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法，以解决现有方法步骤繁琐，对仪器要求高，常需要高效液相色谱仪、核酸蛋白层析仪等进行分离纯化，所涉及到的色谱柱、填料价格均较昂贵，纯化周期较长等问题。为解决上述问题，拟采用这样一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法：①九香虫血淋巴提取：采集九香虫成虫，冰箱冷冻致死，用1ml注射器从九香虫腹部提取血淋巴液，注入含有PMSF的离心管中，12000r/min，离心10min，用移液器吸取中间层组分，命名为组分Ⅰ；②沸水水浴使无抗肿瘤活性蛋白变性：将装有组分Ⅰ的离心管放置于97℃水浴条件下处理30min，离心10min，弃沉淀，保留上清，该上清命名为组分Ⅱ；③硫酸铵层析蛋白：称取7.67g硫酸铵固体，边搅拌边往上述组分Ⅱ上清液中缓慢加入已称量好的固体硫酸铵粉末，使得终体积为10ml，静置1h，离心10min，收集沉淀，PBS复溶重悬，该重悬液命名为组分Ⅲ；④超滤：将上述组分Ⅲ用10KDa超滤管超滤20min(3000r/min，4℃)，吸取内管中液体放置于30KDa超滤管中继续超滤20min(3000r/min，4℃)，取外管中液体，命名为组分Ⅳ；⑤组分Ⅳ的抗癌效果检测及蛋白分子量检测：采用用MTT法检测组分Ⅳ对胃癌生长的抑制率，SDS-PAGE法检测组分Ⅳ的分子量大小。前述方法中，步骤①的具体方法如下：野外采集九香虫成虫带回实验室，冰箱冷冻致死，将其头部及翅膀一起掰下，剩余部分放入底部带孔的内离心管中，将内离心管插入到外离心管中；经过离心后使虫体中的血淋巴液被分离到外离心管中，从而获得九香虫血淋巴液与虫体；将得到的血淋巴液吸入装有含有0.5mmol/L的PMSF的离心管中，12000r/min，4℃离心10min，吸取血淋巴水溶性组分于新的离心管中，制得血淋巴液水溶性组分，bradford检测蛋白含量，冷冻干燥，用PBS配置成相应浓度，过滤除菌备用；前述方法中，步骤②的具体方法如下：取无菌15ml离心管，将上述装有血淋巴水溶性组分的离心管在97℃水浴条件下处理30min，离心10min(12000r/min，4℃)，弃沉淀，保留上清，分别用0.22μm滤膜过滤除菌，并立即用于抗癌活性检测，获得活性组分Ⅱ，用于下一步分离纯化；前述方法中，步骤③的具体方法如下：称取7.67g硫酸铵固体，边搅拌边往上述血淋巴上清液中缓慢加入已称量好的固体硫酸铵粉末，避免固体硫酸铵在烧杯底部形成沉积，终体积为10ml，静置1h，将上清液装入活化好的透析袋中并在冰浴下透析，而后，离心10min(12000r/min，4℃)，收集沉淀，PBS复溶重悬，获得组分Ⅲ，MTT法检测抗癌活性。前述方法中，步骤⑤通过MTT法检测各组分的抗癌活性：(1)用0.25％胰蛋白酶溶液消化胃癌SGC-7901，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板上，每孔细胞悬液体积为100μl，每组四孔；(2)待细胞贴壁后分别加入纯化的各组分，设无药对照组和空白调零组，在二氧化碳培养箱中37℃、5％二氧化碳浓度下分别培养48h；(3)取出培养板，每孔加入5g/LMTT溶液10μl，在37℃继续孵育4h，每孔加入100μlFormazan溶解液，继续培养4h，待结晶充分溶解，在波长570nm处测定OD值，抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝1-(药物组OD值-空白对照OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)]×100％。本专利技术主要基于申请人在实验中发现九香虫抗癌活性组分具有耐高温特点及摸索到了其蛋白质分子量范围所建立的快速纯化九香虫抗癌活性组分的方法，该方法对仪器要求低，仅需要一台离心机、一台水浴锅，纯化周期短，2h即可获得所需的抗癌活性组分。本专利技术所述的纯化步骤包括：高温处理、硫酸铵层析蛋白、超滤。一般情况下，当加热至95℃时，提取物中大部分蛋白会失活并析出，但部分耐热蛋白生物活性依然很强。用热稳定性纯化方案的实例有Stathmin、大肠杆菌碱性磷酸酶和肌肉磷酸酶抑制剂-1，本研究发现，九香虫血淋巴经过97℃处理有大量蛋白变性沉淀，经12000r/min离心10min，收集上清，过滤除菌进行抗癌活性检测发现，该上清仍有抗癌活性，并且相同剂量处理后的血淋巴液对癌细胞的抑制作用比粗提液更强，故在实验初期可将热处理作为前期大量富集抗癌活性物质的有效方法。“盐析”常用于蛋白质分离纯化的粗提步骤。其主要原理是：在蛋白质溶液中加入中性盐后，由于盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。在实验初期，中性盐可影响需浓缩蛋白质间的非极性(疏水)相互作用和静电相互作用。蛋白质表面的静电电荷感应诱导了构象而使其无法充分溶剂化来阻止聚集，故蛋白质能溶于浓度低的盐溶液中，却很少溶解或者不溶解于水中，可通过增加少量盐类中和表面静电力来提高蛋白的电荷作用。当盐浓度超过0.2mol/L时不仅能中和蛋白质表面的静电力，同时也将水分子从蛋白质中带走了，而这些水分子对于蛋白质的溶解是必备的，盐类竞争水分子。当离子浓度达到一定高度时，蛋白质间通过相互作用而中和表面的电荷，本实验采用饱和硫酸铵盐析。超滤是一种膜分离过程，其利用的是压力活性膜，按分子量大小来分离颗粒。在外界压力作用下，溶解物质和比膜孔径小的物质将作为透过液透过膜，从而达到溶液的净化、分离与浓缩的目的。本实验采用10KDa和30KDa两种超滤膜，将蛋白质溶液分为3部分，除去了大部分的杂质。实验前期，笔者曾尝试用血淋巴粗提液进行超滤，但发现超滤膜污染严重，为了提高膜的透过通量，保证超滤膜的正常稳定运行，于是选择先对血淋巴进行预处理，将超滤放在热处理、盐析之后，且最好每次都进行高速离心操作以除去中间过程的变性蛋白，即使在冰箱中储存一段时间未打开瓶盖，也须在超滤前进行低温高速离心处理，但由此也可能引起实验偏差，造成不同批次，不同时间的样品实验重复性不好，故在尽可能短的时间完成以上分离纯化操作是本研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法，其特征在于，具体方法如下：①九香虫血淋巴提取：采集九香虫成虫，冰箱冷冻致死，用1ml注射器从九香虫腹部提取血淋巴液，注入含有PMSF的离心管中，12000r/min，离心10min，用移液器吸取中间层组分，命名为组分Ⅰ；②沸水水浴使无抗肿瘤活性蛋白变性：将装有组分Ⅰ的离心管放置于97℃水浴条件下处理30min，离心10min，弃沉淀，保留上清，该上清命名为组分Ⅱ；③硫酸铵层析蛋白：称取7.67g硫酸铵固体，边搅拌边往上述组分Ⅱ上清液中缓慢加入已称量好的固体硫酸铵粉末，使得终体积为10ml，静置1h，离心10min，收集沉淀，PBS复溶重悬，该重悬液命名为组分Ⅲ；④超滤：将上述组分Ⅲ用10KDa超滤管超滤20min，吸取内管中液体放置于30KDa超滤管中继续超滤20min，取外管中液体，命名为组分Ⅳ；⑤组分Ⅳ的抗癌效果检测及蛋白分子量检测：采用用MTT法检测组分Ⅳ对胃癌生长的抑制率，SDS‑PAGE法检测组分Ⅳ的分子量。

【技术特征摘要】
1.一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法，其特征在于，具体方法如下：①九香虫血淋巴提取：采集九香虫成虫，冰箱冷冻致死，用1ml注射器从九香虫腹部提取血淋巴液，注入含有PMSF的离心管中，12000r/min，离心10min，用移液器吸取中间层组分，命名为组分Ⅰ；②沸水水浴使无抗肿瘤活性蛋白变性：将装有组分Ⅰ的离心管放置于97℃水浴条件下处理30min，离心10min，弃沉淀，保留上清，该上清命名为组分Ⅱ；③硫酸铵层析蛋白：称取7.67g硫酸铵固体，边搅拌边往上述组分Ⅱ上清液中缓慢加入已称量好的固体硫酸铵粉末，使得终体积为10ml，静置1h，离心10min，收集沉淀，PBS复溶重悬，该重悬液命名为组分Ⅲ；④超滤：将上述组分Ⅲ用10KDa超滤管超滤20min，吸取内管中液体放置于30KDa超滤管中继续超滤20min，取外管中液体，命名为组分Ⅳ；⑤组分Ⅳ的抗癌效果检测及蛋白分子量检测：采用用MTT法检测组分Ⅳ对胃癌生长的抑制率，SDS-PAGE法检测组分Ⅳ的分子量。2.根据权利要求1所述一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法，其特征在于，步骤①的具体方法如下：野外采集九香虫成虫带回实验室，冰箱冷冻致死，将其头部及翅膀一起掰下，剩余部分放入底部带孔的内离心管中，将内离心管插入到外离心管中；经过离心后使虫体中的血淋巴液被分离到外离心管中，从而获得九香虫血淋巴液与虫体；将得到的血淋巴液吸入装有含有0.5mmol/L的PMSF的离心管中，12000r/min，4℃离心10min，吸取血淋巴水溶性组分于新的离心管中，制得血淋巴液水溶性组分，bradford检测蛋白含量，冷冻干燥，用PBS配置成相应浓度，过滤除菌备用。3.根据权利要求1所述一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法，其特征在于，步骤②的具体方法如下：取无菌15ml离心管...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭建军，檀军，田莹，曹米兰，吴有芳，赵帅，张书琪，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52