The present invention provides a rapid method for separating and purifying the antitumor protein components of nine scent insects. Through high temperature treatment, ammonium sulphate chromatography protein and ultrafiltration, the rapid separation and purification of antitumor protein components of nine insect pests are realized in order to solve the tedious procedure of the existing methods, high requirement for the instrument, and often need high performance liquid chromatograph and nucleic acid protein. Chromatography and other separation and purification, the columns and fillers involved are expensive, and the purification cycle is long. The invention belongs to the field of biological technology.
【技术实现步骤摘要】
一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法
本专利技术提供一种九香虫抗肿瘤蛋白组分的快速分离纯化方法,属于生物
技术背景九香虫(AspongopuschinensisDallas)是昆虫纲半翅目兜蝽科昆虫,又称黑兜虫、瓜黑蝽、屁板虫、蜣螂虫、打屁虫和屁巴虫等,属东洋区系。因其理气止痛、温中助阳的功能以及含有抗癌、抗菌、抗凝血的药用成分而倍受人们的重视,然而其抗癌药用成分尚不明确。九香虫抗癌“知其然,不知其所以然”的境遇严重阻碍了它被国际学术界关注的进程,是九香虫资源深层次开发利用的桎梏,故急需对九香虫抗癌活性成分进行更深入的研究,为九香虫抗癌药物的研发及应用提供依据。笔者通过前期实验发现,九香虫血淋巴水溶性组分对胃癌SGC-7901增殖具有很强的抑制作用,进一步的研究结果显示,血淋巴水溶性组分能通过诱导胃癌SGC-7901凋亡而达到抗癌作用。但常规分离纯化抗癌活性组分的方法步骤繁琐,对于仪器要求很高,常需要高效液相色谱仪、核酸蛋白层析仪等进行分离纯化,所涉及到的色谱柱、填料价格均较昂贵,纯化周期较长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于:提供一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法,以解决现有方法步骤繁琐,对仪器要求高,常需要高效液相色谱仪、核酸蛋白层析仪等进行分离纯化,所涉及到的色谱柱、填料价格均较昂贵,纯化周期较长等问题。为解决上述问题,拟采用这样一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法:①九香虫血淋巴提取:采集九香虫成虫,冰箱冷冻致死,用1ml注射器从九香虫腹部提取血淋巴液,注入含有PMSF的离心管中,12000r/min,离心10min ...
【技术保护点】
一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法,其特征在于,具体方法如下:①九香虫血淋巴提取:采集九香虫成虫,冰箱冷冻致死,用1ml注射器从九香虫腹部提取血淋巴液,注入含有PMSF的离心管中,12000r/min,离心10min,用移液器吸取中间层组分,命名为组分Ⅰ;②沸水水浴使无抗肿瘤活性蛋白变性:将装有组分Ⅰ的离心管放置于97℃水浴条件下处理30min,离心10min,弃沉淀,保留上清,该上清命名为组分Ⅱ;③硫酸铵层析蛋白:称取7.67g硫酸铵固体,边搅拌边往上述组分Ⅱ上清液中缓慢加入已称量好的固体硫酸铵粉末,使得终体积为10ml,静置1h,离心10min,收集沉淀,PBS复溶重悬,该重悬液命名为组分Ⅲ;④超滤:将上述组分Ⅲ用10KDa超滤管超滤20min,吸取内管中液体放置于30KDa超滤管中继续超滤20min,取外管中液体,命名为组分Ⅳ;⑤组分Ⅳ的抗癌效果检测及蛋白分子量检测:采用用MTT法检测组分Ⅳ对胃癌生长的抑制率,SDS‑PAGE法检测组分Ⅳ的分子量。
【技术特征摘要】
1.一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法,其特征在于,具体方法如下:①九香虫血淋巴提取:采集九香虫成虫,冰箱冷冻致死,用1ml注射器从九香虫腹部提取血淋巴液,注入含有PMSF的离心管中,12000r/min,离心10min,用移液器吸取中间层组分,命名为组分Ⅰ;②沸水水浴使无抗肿瘤活性蛋白变性:将装有组分Ⅰ的离心管放置于97℃水浴条件下处理30min,离心10min,弃沉淀,保留上清,该上清命名为组分Ⅱ;③硫酸铵层析蛋白:称取7.67g硫酸铵固体,边搅拌边往上述组分Ⅱ上清液中缓慢加入已称量好的固体硫酸铵粉末,使得终体积为10ml,静置1h,离心10min,收集沉淀,PBS复溶重悬,该重悬液命名为组分Ⅲ;④超滤:将上述组分Ⅲ用10KDa超滤管超滤20min,吸取内管中液体放置于30KDa超滤管中继续超滤20min,取外管中液体,命名为组分Ⅳ;⑤组分Ⅳ的抗癌效果检测及蛋白分子量检测:采用用MTT法检测组分Ⅳ对胃癌生长的抑制率,SDS-PAGE法检测组分Ⅳ的分子量。2.根据权利要求1所述一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法,其特征在于,步骤①的具体方法如下:野外采集九香虫成虫带回实验室,冰箱冷冻致死,将其头部及翅膀一起掰下,剩余部分放入底部带孔的内离心管中,将内离心管插入到外离心管中;经过离心后使虫体中的血淋巴液被分离到外离心管中,从而获得九香虫血淋巴液与虫体;将得到的血淋巴液吸入装有含有0.5mmol/L的PMSF的离心管中,12000r/min,4℃离心10min,吸取血淋巴水溶性组分于新的离心管中,制得血淋巴液水溶性组分,bradford检测蛋白含量,冷冻干燥,用PBS配置成相应浓度,过滤除菌备用。3.根据权利要求1所述一种快速分离纯化九香虫抗肿瘤蛋白组分的方法,其特征在于,步骤②的具体方法如下:取无菌15ml离心管...
【专利技术属性】
技术研发人员:郭建军,檀军,田莹,曹米兰,吴有芳,赵帅,张书琪,
申请(专利权)人:贵州大学,
类型:发明
国别省市:贵州,52
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