一种重组果胶甲酯酶pmeA及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组果胶甲酯酶pmeA及其编码基因与应用。本发明专利技术是根据GenBank上已公布的黑曲霉pmeA的氨基酸序列，然后根据宿主菌的密码子偏好性，对密码子进行优化，从而得到了pmeA基因的新的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的重组果胶甲酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。pmeA基因与pCuGAPGαAL表达载体连接后，将重组质粒pCuGAPGαAL‑pmeA整合到产朊假丝酵母基因组中，实现了pmeA基因的异源表达。该重组果胶甲酯酶可以高效催化果胶中的甲氧基水解，降低果胶酯化度，可用于食品、医药和化工行业的生产中。

A recombinant pectin methesterase pmeA and its coding genes and Application

The invention discloses a recombinant pectin methesterase pmeA and its coding gene and application. The present invention is based on the amino acid sequence of Aspergillus niger pmeA published on GenBank, and then optimizes the codon according to the codon preference of the host bacteria, thus the new nucleotide sequence of the pmeA gene, such as SEQ ID NO.1, is obtained, and the amino acid sequence of the recombinant pectin methyleesterase, such as SEQ ID, NO.2, is expressed. After the pmeA gene was connected with the pCuGAPG alpha AL expression vector, the recombinant plasmid pCuGAPG alpha AL pmeA was integrated into the genome of Candida utilis, and the heterologous expression of the pmeA gene was realized. The recombinant pectin methesterase can efficiently catalyze methoxyl hydrolysis in pectin, reduce the degree of pectin esterification, and can be used in the production of food, medicine and chemical industry.

【技术实现步骤摘要】
一种重组果胶甲酯酶pmeA及其编码基因与应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及重组果胶甲酯酶及其应用。
技术介绍
果胶在植物中的含量比较丰富，主要以高甲氧基果胶形式存在。对于低甲氧基果胶，可供提取的天然植物很少，迄今为止国内外报道最多的就是在向日葵中提取到了低甲氧基果胶。但是向日葵种植面积小，且受温度、季节的影响，不利于低酯果胶的商业发展。目前生产低酯产果胶的方法有：酸法、浓氨水法、碱法和果胶甲酯酶酶解法。前两种方法的缺点是反应缓慢；碱法降酯速度快，但是会破坏果胶的聚合度；果胶甲酯酶可以迅速的将果胶分子进行去甲基化反应，可以达到将高甲氧基果胶转化为低甲氧基果胶的目的，由此酶法生产低甲氧基果胶亟需规模化。高酯果胶在pH3.0～5.0，可溶性固形物>55％时才能形成凝胶，而低酯果胶只要有微量的Ca2+等金属离子存在时，在较宽的pH范围内都可以形成果胶。低酯果胶满足了人们对低糖、低热量、低甜度食品的要求，被消费者认为是高质量的产品，是很好的食品稳定剂、胶凝剂或增稠剂。目前通过基因工程技术生产酶制剂已成为工业酶的主导。果胶甲酯酶(Pectinmethylesterase，PME)属于碳水化合物酯酶第8家族的羧酸酯酶，对甲酯化程度较高的果胶有最高酶活，其方式是通过使同型半乳糖醛酸寡聚糖主链上半乳糖醛酸的C-6基上的甲氧基发生去酯化作用，释放出游离羧基端和甲醇，重塑了果胶的结构，对果胶后续的解聚反应和凝胶的形成有很大的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种果胶甲酯酶编码基因、含有该基因的表达载体和异源表达该重组果胶甲酯酶的工程菌。本专利技术的另一目的提供上述重组果胶甲酯酶的应用。本专利技术通过基因工程技术得到了一种新的果胶甲酯酶基因，并将其进行重组表达，得到的重组果胶甲酯酶。本专利技术首先取得GenBank上已公布的黑曲霉pmeA的氨基酸序列，然后根据产朊假丝酵母的密码子偏好性，对其密码子进行优化，从而得到了pmeA基因的新的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其结构基因全长996bp，包含信号肽序列。本专利技术所述的果胶甲酯酶基因pmeA表达的重组果胶甲酯酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，包含331个氨基酸，理论分子量为36.41kDa。重组果胶甲酯酶的表达方法，包括以下步骤：(1)根据宿主菌的密码子偏好性，对获得的pmeA基因的密码子进行优化，从而到了pmeA基因的新的核苷酸序列；(2)优化后的pmeA基因与表达载体pCuGAPGαAL连接，构建重组质粒pCuGAPGαAL-pmeA；(3)重组质粒pCuGAPGαAL-pmeA转化大肠杆菌，筛选出阳性克隆；(4)重组质粒pCuGAPGαAL-pmeA转化产朊假丝酵母，筛选阳性克隆，活化后保种，得到C.U-pmeA重组菌；(5)比较筛选到的几株重组菌的果胶甲酯酶酶活，从中筛选酶活最高的一株；(6)重组菌C.U-pmeA高密度培养，分离上清，即为重组果胶甲酯酶粗酶液。本专利技术所述的重组果胶甲酯酶经SDS-PAGE电泳后活性染色分析，有两个条带分别为40kDa和45kDa。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术所述的重组果胶甲酯酶最适温度为40℃，最适pH为4.0，高密度培养168h后的酶活为107.3U/ml。本专利技术所述的重组果胶甲酯酶粗酶液在酶量为3mg/g底物，温度为40℃，pH为4.0的条件下水解果胶，当酶解120min时果胶的酯化度由原来的68.41％下降为44.71％(＜50％)，属于低酯果胶的范畴。该重组酶不仅可以用于制备低酯果胶，还可以用于果汁澄清和棉麻脱脂等。附图说明图1为重组果胶甲酯酶异源表达载体pCuGAPGαAL-pmeA的构建。图2为表达载体pCuGAPGαAL-pmeA转大肠杆菌阳性克隆子的鉴定。其中，图2中，M：100～2000bp的DNAMarker，1～6号是挑的单菌落，7号是阴性对照。图3为表达载体pCuGAPGαAL-pmeA转化产朊假丝酵母阳性克隆的筛选。其中，图3中，M：100bp～2000bp的DNAmarker，1～3是3个克隆的PCR结果，4号是阴性对照PCR结果。图4为重组果胶甲酯酶的活性染色。其中，图4中，M：10～170kDa的蛋白Marker，1：胞外上清液，2：含pCuGAPGαAL空载的重组产朊假丝酵母菌的胞外上清液，3：野生产朊假丝酵母菌的胞外上清液，4、5、6是1、2、3的活性染色。图5为重组产朊假丝酵母的生长曲线和酶活曲线。图6为重组果胶甲酯酶的最适温度曲线。图7为重组果胶甲酯酶的最适pH曲线。图8为重组果胶甲酯酶酶解果胶制备低酯果胶。具体实施方式通过以下实施例进一步详细说明本专利技术，但应注意本专利技术的范围并不受这些实施例的限制。实验菌株与质粒：1.大肠杆菌DH5α为本实验室保藏菌种；2.产朊假丝酵母ATCC22023购于广东省微生物菌种保藏中心；3.整合表达载体pCuGAPGαAL(含有产朊假丝酵母的GAP启动子，G418抗性基因)，由本实验室构建；4.引物合成及测序由Invitrogen公司完成。培养基：1.LB培养基：0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％氯化钠，1.5％～2％琼脂粉(固体培养基)蒸馏水溶解后，121℃，高压灭菌20min，4℃保存。2.含氨苄青霉素的LB培养基：在LB培养基中加入100mg/mL的氨苄青霉素钠，使其终浓度为100μg/mL。3.含卡那霉素的LB培养基：在LB培养基中加入50mg/mL的卡那霉素，使其终浓度为50μg/mL。4.YPD培养基：1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖(先配成20％的葡萄糖，单独灭菌，使用前加入)，蒸馏水溶解后，121℃高压灭菌20min，4℃保存。5.含G418的YPD培养基：在YPD培养基中加入300mg/mL的G418母液，使其终浓度为300μg/mL。6.YPDG培养基：1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，0.5％葡萄糖，0.5％甘油，蒸馏水溶解后，121℃高压灭菌20min，4℃保存。实施例1：重组果胶甲酯酶的重组表达1.重组果胶甲酯酶基因pmeA的获取：参照NCBI中GenBank上已公布的黑曲霉pmeA的氨基酸序列。然后根据产朊假丝酵母的密码子偏好性，采用最高频率密码子对基因序列进行密码子优化。为了方便后续的分子克隆，在上述序列5’端加入Bsp119I酶切位点，在3’端加入XbaI酶切位点，优化后的序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成。2.pmeA基因片段克隆进pCuGAPGαAL表达载体：(1)pUC57-pmeA质粒的提取，参照美基质粒小量快速抽提试剂盒的操作说明。(2)质粒pUC57-pmeA和pCuGAPGαAL的双酶切。用限制性内切酶Bsp119I和XbaI分别酶切pUC57-pmeA质粒和pCuGAPGαAL质粒，反应体系为50μL：37℃水浴1h后，琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。(3)酶切产物的胶回收，根据美基生物公司的凝胶DNA微量回收试剂盒回收酶切产物。(4)pmeA片段与质粒pCuGAPGαAL片段的连接将回收到的pmeA片段和载体pCuGAPGαAL片段按照摩尔比为10:1的比例进行连接，连接体系为20μL：22℃连接1h后，取出保存至-20℃，待后续转化大肠杆菌(5)重组载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组果胶甲酯酶pmeA基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组果胶甲酯酶pmeA基因，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种权利要求1所述果胶甲酯酶pmeA基因编码的重组果胶甲酯酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求1所述果胶甲酯酶pmeA基因的表达载体。4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于出发载体为pCuGAPGαAL。5.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的表达载体。6.如权利要求书5所述的基因工程菌，其特征在于所述宿主菌为产朊假丝酵母菌、酿酒酵母或毕赤酵母。7.权利要求2所述重组果胶甲酯酶的表达方法，其特征在于包括以下步骤：(1)根据宿主菌的密码子偏好...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘泽寰，林蒋海，李帅，
申请(专利权)人：广东利世康低碳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44