一种柳枝稷腺苷高半胱氨酸在改变木质素单体和提高细胞壁降解效率方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一个一碳代谢关键酶基因

【技术实现步骤摘要】
一种柳枝稷腺苷高半胱氨酸在改变木质素单体和提高细胞壁降解效率方面的应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及柳枝稷一碳代谢腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteinehydrolase1，SAHH1）的分子调控，以研究其对木质素代谢以及细胞壁降解效率的影响。
技术介绍
细胞壁是植物储存生物质和能量的主要场所。而细胞壁中的纤维素（Cellulose）和半纤维素（Hemicellulose），不但可以作为牧草饲料，还可用于微生物发酵生产乙醇和丁醇等生物能源。植物细胞壁成分除纤维素、半纤维素以为，还存在另一成分木质素（lignin）。木质素在生物体内起到支撑细胞、维持水分运输、增强植物抗逆和抵抗病虫害入等生理功能，但是在生物能源转化方面和牧草消化方面，木质素是重要的限制因子，它的存在使得纤维素降解效率显著降低。柳枝稷（PanicumvirgatumL.）属于禾本科（Gramineae）黍属（Panicum）的C4多年生草本植物。其产量稳定、适应性强、地理分布广且不占用耕地，既是重要的牧草来源也是理想的第二代能源植物。近年来，柳枝稷的基因组数据、转录组数据以及相关芯片数据已陆续释放，同时，柳枝稷的遗传转化体系也已经成熟稳定，因此柳枝稷已经成为能源草和禾本科牧草研究的理想模式植物。因此，解析柳枝稷木质素代谢的调控机制，为分子育种提供新的靶向位点具有重要的现实意义。一碳代谢指的是含有一个碳原子的基团（如甲基、甲烯基、甲炔基、甲酰基等）的生成、转变、运输以及参与物质合成的反应过程。主要包括两个循环：四氢叶酸循环（THF）和甲硫氨酸循环(MET)。一碳代谢合成的甲硫氨酸可以进一步生成甲基活性供体S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）。SAM为木质素甲基化反应提供甲基供体，最终生成甲基化程度不同的G型和S型单体，从而将一碳代谢和木质素代谢偶联起来。S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine,SAH）是SAM的去甲基化形式，研究发现SAH能够与SAM竞争性结合甲基化酶，从而抑制甲基化反应的进行（Keatingetal.,EvidenceofbrainmethyltransferaseinhibitionandearlybraininvolvmentinHIV-positivepatients,1991,Lancet,337(8747):935-9;Nguyenetal.,Hypodipsichypernatremiaanddiabetesinsipidusfollowinganteriorcommunicatingarteryaneurysmclipping:diagnosticandtherapeuticchallengesintheamnesticrehabilitationpatient,BrainInj,15(11):975-80）。SAHH对于维持植物体内SAH的水平具有重要作用（Hansonetal.,One-carbonmetabolisminhigherplants,2001,AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,52:119-137）。拟南芥中sahh1突变体表现出明显的发育表型（Rochaetal.,TheArabidopsisHOMOLOGY-DEPENDENTGENESILENCING1genecodesforanS-adenosyl-L-homocysteinehydrolaserequiredforDNAmethylation-dependentgenesilencing,PlantCell,17(2):404-417）,但是SAHH对木质素合成的影响目前尚未有报道。木质素合成途径中单体的甲基化反应是由咖啡酰-O-甲基转移酶（CCoAOMT）和咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）催化进行的，而甲基基团是由一碳代谢的产物SAM来提供。研究报道，改变玉米四氢叶酸运输循环中的亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和拟南芥中叶酰多谷氨酸合成酶（FPGS1）编码基因的表达量能够显著影响木质素单体累积（Tangetal.,Themaizebrownmidrib2(bm2)geneencodesamethylenetetrahydrofolatereductasethatcontributestoligninaccumulation.PlantJournal.2014,77(3):380-392;Zhouetal.,FolatePolyglutamylationIsInvolvedinChromatinSilencingbyMaintainingGlobalDNAMethylationandHistoneH3K9DimethylationinArabidopsis.PlantCell.2013,25(7):2545-2559）。但是甲硫氨酸途径对木质素的影响，目前尚未有相关报道。本专利技术主要针对柳枝稷的SAHH1，通过干扰沉默技术获得PvSAHH在体内表达抑制的转基因柳枝稷，研究表明SAH显著升高，甲基化木质素单体显著降低，最终使得细胞壁降解效率显著升高，这为深入理解柳枝稷和其他禾本科植物木质素调控机理奠定理论基础，同时也为采用基因工程手段改变木质素提供了新的靶基因源和方向指导。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种柳枝稷一碳代谢S-腺苷高半胱氨酸水解酶PvSAHH1的编码基因；其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述核苷酸序列进行同义突变，也属于本专利技术的保护范围内。本专利技术的第二个目的提供一种针对柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1调控区片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。利用此片段能够显著降低甲基化木质素单体G型和S型的含量，增加细胞壁降解效率。本专利技术的第三个目的提供一种柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1的干扰沉默表达载体，该表达载体克隆上述SEQIDNO.3片段。本专利技术的第四个目的是提供柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1对调控甲基活性供体SAM以及其去甲基化形式SAH方面的应用。本专利技术的第五个目的是提供柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1在调控柳枝稷木质素代谢方面的应用。本专利技术的第六个目的是提供柳枝稷一碳代谢酶类基因PvSAHH1在提高细胞壁降解效率方面的应用。所述柳枝稷PvSAHH1的调控区片段，基于Gateway技术重组整合到超表达载体pANIC8B中；采用农杆菌AGL1介导的遗传转化方法，将干扰载体导入柳枝稷低地型品种Alamo的胚性愈伤细胞中，通过潮霉素抗性筛选，获得抗性再生植株，并通过PCR分析最终确定阳性转基因植株；代谢物测定数据表明转基因柳枝稷中SAH水平显著升高，SAM/SAH比值显著降低；木质素数据表明甲基化木质素单体G型和S型显著降低；细胞壁降解效率显著升高。本专利技术的核心特点和专利技术理念包括：1、本专利技术针对柳枝稷木质素这一制约生物能源转化的主要限制因子，通过先进的基因工程技术对其进行调控，能够获得显著效果。2、本专利技术探索的Pv本文档来自技高网...

【技术保护点】
柳枝稷一碳代谢酶基因SAHH1的全长CDS，其特征在于：（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.柳枝稷一碳代谢酶基因SAHH1的全长CDS，其特征在于：（1）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的PvSAHH全长CDS编码的氨基酸序列，其特征在于：（1）SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的PvCGS的核苷酸序列中选取一段序列保守功...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春祥，白泽涛，齐天雄，吴振映，刘金丽，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37