多菌灵降解酶CbmA及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术属于应用环境微生物和农业领域，公开了多菌灵降解酶CbmA及其编码基因和应用。本发明专利技术降解多菌灵降解酶基因cbma的开放阅读框全长为1434bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物CbmA含477个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2。CbmA能降解多菌灵。基因cbma可用于构建降解多菌灵的转基因工程菌及研发降解菌剂，降解酶CbmA可制备酶制剂用于消除土壤、水体和农产品中多菌灵的残留。

【技术实现步骤摘要】
多菌灵降解酶CbmA及其编码基因和应用
本专利技术属于应用环境微生物和农业领域，涉及多菌灵降解酶CbmA及其编码基因和应用。
技术介绍
杀菌剂是防治作物病害最重要的武器。多菌灵(Carbendazim)，化学名称为苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，别名有棉萎灵、苯并咪唑44号、棉萎丹、MBC等，分子式为C9H9N3O2，分子量为191.19g·mol-1，为浅灰色粉末，水溶性为8mg·L-1。于1973年开发，是农业生产过程中使用广泛，频率较高的一种杀菌剂，市场上有多种复配剂。多菌灵是全世界广泛用于农业、林业中真菌病害防治的广谱、内吸性苯并咪唑类杀菌剂。多用于防治谷物和水果，如棉花、花生、小麦、甜菜、甘蔗、番茄、柑橘、香蕉、草莓、菠萝和梨果等植物的病害。多菌灵也是很多苯并咪唑类杀菌剂的水解产物和活性成分。由于多菌灵多用于作物生长后期的病害防治及采摘后的贮存，所以，在农产品中较容易检测到残留。这些残留经常出现在日常生活中常见的食物，如水果、蔬菜、粮食、油料和中药材等。2014年，国家发布实施的《食品中最大农药残留量限量标准》(GB2763-2014)中，多菌灵在绝大多数粮食及果蔬中含量不得超过0.5mg·kg-1。在欧盟被视为危险物质，在美国已被列入禁用列表，但仍然在许多发展中国家，如中国、印度等广泛使用。要利用微生物(酶)降解技术解决多菌灵残留问题首先要获得优良的菌株和基因资源。目前已经报道了一些降解多菌灵的菌株，但多菌灵水解酶的报道只有一个酰胺酶MheI，表达效果也并不理想，这就限制了人们利用微生物(酶)降解技术消除土壤和农产品上的多菌灵残留。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供新的多菌灵降解酶CbmA与其编码基因cbma以及二者的应用。基因cbma可用于构建降解多菌灵的降解菌液，亦可用于生产降解多菌灵的酶制剂，用于消除土壤、水体和农产品中多菌灵残留。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一株多菌灵降解菌djl-6-2,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:M2017441。基因cbma的出发菌株Rhodococcusjialingiaedjl-6-2保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017441。质谱分析结果表明菌株djl-6-2的粗酶液可以通过水解多菌灵的C-N键来降解多菌灵。一种多菌灵降解酶基因cbma，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。克隆多菌灵降解酶基因的策略为蛋白纯化结合基因组学的方法。通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-SepharoseFF离子柱层析、Q-SepharoseFF离子柱层析和Superdex-200凝胶层析4步纯化流程获得了满足MALDI-TOF-MS技术分析条件的多菌灵水解酶样品。肽指纹图谱鉴定结合菌株基因组完成图测序结果分析，确定编码该蛋白的ORF为orf04383。ORF分析显示，该基因全长为1434bp，编码477aa。通过氨基酸序列比对(Swiss-Prot)发现，CbmA与来自Rhodococcuserythropolis的Acylamidase具有最高的相似性(96％)，其余蛋白的相似性都小于34％，与之前的多菌灵水解酶MheI相似性很低，表明CbmA是一个新的多菌灵水解酶。所述cbma基因所编码的酶CbmA，其氨基酸序列为：SEQIDNO.2。含有所述cbma基因的重组表达载体。所述的重组表达载体优选将所述cbma基因插入pET-29a(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。含有所述cbma的基因工程菌。所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。所述cbma基因在构建降解多菌灵的基因工程菌中的应用。所述cbma基因在去除农产品、土壤和水体中多菌灵残留中的应用。所述降解酶CbmA在降解多菌灵中的应用。所述降解酶CbmA在去除农产品、土壤和水体中多菌灵残留中的应用。所述重组表达载体在构建降解多菌灵的的降解菌剂中的应用。所述含重组表达载体的基因工程菌在去除水体中多菌灵残留中的应用。有益效果1.本专利技术筛选获得一株Rhodococcusjialingiaedjl-6-2，质谱分析结果表明菌株djl-6-2的粗酶液可以水解多菌灵生成2-氨基苯并咪唑。在此基础上，本专利技术用蛋白纯化的方法成功从菌株djl-6-2(CCTCCNO.M2017441)中克隆出基因cbma。在GenBank比对结果表明该基因为一个酰胺酶基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为1434bp，编码477个氨基酸。2.本专利技术中的降解酶CbmA或携带cbma基因的工程菌能高效降解多菌灵。基因cbma可用于构建降解多菌灵的转基因微生物或植物，亦可用于生产降解多菌灵的酶制剂，用于消除土壤、水体和农产品中多菌灵残留。附图说明图1水解酶基因cbma肽指纹图谱鉴定结果。图2水解酶CbmA蛋白电泳图谱；其中泳道1为蛋白质marker，泳道2为破碎粗酶液，泳道3为纯化的水解酶CbmA蛋白。图3水解酶CbmA催化的降解多菌灵的HPLC/MS图谱；a：保留时间为5.15min多菌灵的一级质谱图；b：保留时间为3.72min2-氨基苯并咪唑的一级质谱图。生物材料保藏信息降解菌djl-6-2，分类命名为Rhodococcusjialingiaedjl-6-2，保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2017441。具体实施方式实施例11.1多菌灵降解菌djl-6-2(CCTCCNO:M2017441)的分离取5g处理多菌灵废水的活性污泥加入100mL的富集培养基中，于温度为30℃，转速为160rpm的摇床中富集培养，以5％的接种量每5d转接到新鲜的MSMC培养基中。转接到第3次时，设计空白对照，即不接种的MSMC培养基同富集培养基在相同条件中培养5d。通过紫外分光光度计和高效液相色谱测定多菌灵的含量，与空白对照相比，多菌灵的含量明显下降，即为有降解活性的富集液。将富集液以10-3～10-8进行梯度稀释，各取0.2mL涂布于加有100mg·L-1多菌灵的MSM固体培养基上，30℃恒温培养箱中倒置培养至有菌落长出，挑取具有不同形态特征的单菌落进行分离纯化，并接种于装有20mLMSMC培养基的50mL三角瓶中，经30℃，160rpm摇床培养5d后，对单菌进行降解活性检测，对有降解活性的菌株按1∶1加入30％已灭菌甘油，保存至-70℃超低温冰箱。基础盐培养基(MSM)配方为(1L)：1.0gNH4NO3,1.0gNaCl,1.5gK2HPO4,0.5gKH2PO4,0.2gMgSO4·7H2O.pH7.0.固体培养基加15.0g琼脂。富集分离培养基(MSMC)：加入多菌灵的基础盐培养基。如无特别说明，添加多菌灵浓度为50mg·L-1作为唯一碳源。降解效果的验证方法：(1)紫外扫描法：加入等体积二氯甲烷于待测样品中，在涡旋振荡器上震荡5～10min，保证多菌灵能被充分萃取。剧烈振荡结束后静置分层，吸取下层有机相或去弃上层水相，加入过量的无水硫酸钠去除残余水分。取处理好的有机相使用岛津UV-2401PC紫外扫描仪于200～350nm连续扫描，根据280nm处多菌灵的特征吸收峰的高低值来确定降解活性。(2)高效液相色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个水解酶基因cbma，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.一个水解酶基因cbma，其特征在于核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.权利要求1所述的水解酶基因cbma编码的水解酶CbmA，其特征在于氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.含有权利要求1所述的水解酶基因cbma的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于将权利要求1所述的水解酶基因cbma插入pET-29a(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。5.含有权利要求1所述的水解酶基因cbma...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪青，王翔，何健，黄星，闫新，蒋建东，陈凯，邱吉国，朱建春，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32