新的降解蛋白金属蛋白酶、其突变体、片段等的用途制造技术

本发明专利技术提供了一种鉴定能够结合降解蛋白的化合物的方法，该方法还可测定样品中能够结合降解蛋白的化合物的量及亲和性。本发明专利技术还提供了用于所述目的的、包含降解蛋白的重组表达载体的宿主细胞以及编码降解蛋白和编码人降解蛋白金属蛋白酶蛋白、其片段或突变体的重组表达载体。本发明专利技术还提供了用于检测骨关节炎和其它基于金属蛋白酶的疾病的体内或体外方法，该方法可以制造成试剂盒产品并以试剂盒的方式来使用。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的蛋白质、其片段和突变体，以及它在检测和测试治疗骨关节炎和其它以金属蛋白酶正调控为特征的疾病的药物方面的用途。这些酶有调的产生和活性在组织结构的正常发育中起着重要作用。但在过量时，这些酶会造成相关组织的病理性破坏。参见，J．Saus等，“人基质金属蛋白酶-3的完整一级结构”，J．Biol．Chem．2636742(1988)。其中许多是含锌金属蛋白酶，例如血管紧张肽转化酶和脑啡肽酶。胶原酶、溶质素及相关酶在介导许多疾病的症状方面具有重要作用，这些疾病包括类风湿关节炎(Mullins，D．E等，Biochim Biophys Acta(1983)695117-214)；骨关节炎(Henderson，B．等，Drugs ofthe Future(1990)15495-508)；癌细胞转移(ibid，Broadhurst，M．J．等，欧洲专利申请276436(1987年公开)，Reich，R．等，48 Cancer Res 3307-3312(1988))；和各种溃疡性疾病。碱灼伤或者假单孢菌aeruginosa、Acanthamoeba、单纯性疱疹和牛痘病毒感染会在角膜内造成溃疡。实际上，在癌组织内进行的金属蛋白酶测定显示，金属蛋白酶水平的升高与转移能力有关。参见，M．J．Duffy等，“在人乳房癌中用ELISA进行的8型和9型基质金属蛋白酶测试”，Br．J．Cancer 711025(1995)。以不希望的金属蛋白酶活性为特征的疾病还包括牙周病、表皮松解大疱和巩膜炎。考虑到金属蛋白酶涉及了多种疾病，人们已经开始试图制备出这类酶的抑制物。现有文献中公开了大量此类抑制物。本专利技术试图提供新的、好在对此类蛋白酶具有特异性的抑制物，它们在治疗由此类蛋白酶介导或调节的疾病方面具有更强的活性。金属蛋白酶抑制物可被用于治疗至少部分地由结构蛋白降解引起的疾病。已经制备出了多种抑制物，但是人们仍然需要金属蛋白酶抑制物的筛选方法来设计出治疗所述疾病的药物。因为基质金属蛋白酶与许多疾病有关，所以人们一直试图鉴定到这种酶的抑制剂。例如，已知TaoI-2和1，10-菲咯啉是金属蛋白酶的抑制剂。参见，J．Arribas等，“各种细胞表面蛋白的胞外域是由一个对金属蛋白酶抑制剂敏感的系统分泌的”，J．Biol．Chem．27111376(1996)。金属蛋白酶是一大类具有多种不同功能的蛋白质。降解蛋白(disintegrin)是锌金属蛋白酶，富含于蛇毒中。哺乳动物降解蛋白是包含约18个已知亚群的一族蛋白。它们起着细胞吸附干扰剂的作为，而且已知在繁殖中十分活跃(例如，在精子对卵的受精作用中，包括两者的融合以及精子的成熟)。这些及其它金属蛋白酶的分子生物学和生物化学已经为人所知。结果，Genbank，即基因序列库，提供了几条金属蛋白酶的序列，其中有些据说编码降解蛋白的片段。例如，1994年2月25日的GenBank登记号Z48444公开了据说是大鼠降解蛋白金属蛋白酶基因的2407核苷酸的大鼠基因；1995年3月2日的GenBank登记号Z48579公开了据说是人降解蛋白金属蛋白酶基因部分序列的1842核苷酸；1994年10月25日的GenBank登记号Z21961公开了据说是牛锌金属蛋白酶基因的部分序列的2397核苷酸。因为金属蛋白酶的种类如此之多，所以人们一直需要ⅰ)专一性检测特定金属蛋白酶的方法和ⅱ)鉴定候选抑制剂的方法。将金属蛋白酶与特定疾病相关联，并利用这些金属蛋白酶作为工具来检测并最终治愈、控制这些疾病或设计出治愈的方法将是十分有益的。专利技术目的本专利技术目的之一是提供一种鉴定能够与降解蛋白结合的化合物的方法。本专利技术另一目的是提供包含降解蛋白的重组表达载体的宿主细胞和编码降解蛋白的重组表达载体。本专利技术另一目的是提供一种检测例如癌症、关节病(包括关节强硬性脊椎炎、类风湿关节炎、痛风性关节炎(痛风)、炎性关节炎、Lyme病和骨关节炎)等由金属蛋白酶介导的疾病的筛选方法。本专利技术另一目的是提供一种所述蛋白的抗体，它可以用在筛选、分离所述蛋白或作为针对所述蛋白的寻靶部分。本专利技术还提供了用于所述目的、包含降解蛋白的重组表达载体的宿主细胞和编码降解蛋白和人降解蛋白金属蛋白酶蛋白、其片段或突变体的重组表达载体。本专利技术还提供了用于检测骨关节炎和其它例如癌症等基于金属蛋白酶的疾病的体内与体外的方法，该方法可以制造成试剂盒并以试剂盒的方式来使用。详细说明“基因”指一段DNA序列，它包括产生成熟蛋白或其前体所必需的调控和编码序列。蛋白可以是由编码序列的全长编码的，也可以是由其中任意一部分编码的，只要具有所需的酶活性。“寡核苷酸”定义为包含两个或两个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，通常包含三个以上，一般是十个以上，可以多达100个或更多(但是以20至30个为佳)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素，这些因素又取决于寡核苷酸最终的功能与用途。寡核苷酸可以用各种方法产生，其中包括化学合成、DNA复制、限制性核酸内切酶消化逆转录产物或以上方法的综合运用。因为单核苷酸反应生成寡核苷酸的方式为一个单核苷酸五糖环的5’磷酸通过磷酸二酯键以同一方向与相邻核苷酸的3’氧结合，所以，如果一段寡核苷酸末端的5’磷酸没有与另一单核苷酸五糖环上的3’氧结合，则称该末端为“5’末端”，如果末端的3’氧没有与下一单核苷酸五糖环上的5’磷酸结合，则称该末端为“3’末端”。在本文中，一段核酸序列，即使它位于一段大核苷酸的内部，也具有5’和3’末端。当两段不同且无重叠的寡核苷酸与同一线性互补核酸序列上不同区域结合时，而且一段寡核苷酸的3’末端指向另一段的5’末端，则称前者为“上游”寡核苷酸，后者为“下游”寡核苷酸。“引物”指这样的寡核苷酸，当所处条件引发引物的延伸时，它能够作为合成的起始点。寡核苷酸引物可以是天然存在的，例如纯化自限制性消化产物，或者是合成的。引物的选择需与模板上一段特定序列“基本”互补。引物必需具有足够的互补性与模板链杂交以便延长引物。引物序列不必完全反映模板的序列。例如，可以在引物的5’末端接一段非互补核苷酸片段而引物的其余序列则与模板链基本互补。非互补碱基或更长的序列可以分散在引物内部，只要引物序列与模板序列的互补性足以杂交形成模板引物复合物以便合成引物的延伸产物。“杂交”法包括令一段互补序列与靶核酸(其序列待测)结合。两个含有互补序列的核苷酸多聚物能够发现彼此并通过碱基配对反应相互结合，这是一种众所周知的现象。Marmur&Lane，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 46453(1960)和Doty等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 46464(1960)最早发现“杂交”过程，其后对该方法的不断改进使之成为了现代生物学的重要工具。但是，有许多问题阻碍了将杂交广泛用于对人的诊断。这些难题中有1)杂交效率低；2)基因组DNA混合物中特定靶序列的浓度低；和3)只是部分互补的探针与靶杂交。至于效率，据实验观察，在杂交反应中只形成了探针-靶复合物可能数中的一部分。用短的寡核苷酸探针(短于100碱基)时，尤其如此。这有三个主要原因a)由于二级结构和三级结构的相互作用而无法杂交；b)含有靶序列的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一段ＤＮＡ片段，它编码在关节炎发展过程中被差异表达的人降解蛋白ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９或其片段，它能够被用于筛选降解蛋白拮抗剂、药物的设计和筛选。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：MH廷德尔，TM哈克基，
申请(专利权)人：普罗克特和甘保尔公司，凯斯西部预备大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]